Учебное пособие по химии для самостоятельной работы студентов медицинских вузов Рекомендуется для студентов, обучающихся по специальностям
жүктеу/скачать 1,06 Mb.
|
Физико-химические методы (1)
- Бұл бет үшін навигация:
- распределительной хроматографии
- ионообменной хроматографии
- молекулярно-ситовой хроматографии (гель-хроматографии)
- биоспецифической (аффинной) хроматографии
| В тонкослойной хроматографии в качестве твёрдого носителя выступает тонкий слой силикагеля, оксида алюминия или различных полимеров, нанесённый на пластинку. Вблизи нижнего края пластинки на слой сорбента наносят пятно анализируемой смеси. После высыхания пятна пластинку погружают в ёмкость с подвижной фазой, которая начинает подниматься по пластинке под действием капиллярных сил. Вместе с подвижной фазой по пластинке перемещаются компоненты смеси, причем с разными скоростями, которые определяются их сорбционными свойствами (рис. 24). После того, как фронт подвижной фазы достигнет верхнего края пластинки, её вынимают, высушивают и при необходимости обнаруживают разделённые зоны по собственной окраске или обработкой окрашивающим реагентом.
Хроматограмма имеет вид нескольких окрашенных пятен различного размера. Отношение пути, пройденного данным веществом, к пути, пройденному подвижной фазой, служит для идентификации вещества (путём сравнения с эталоном), обозначается Rf. А размер пятна и интенсивность его окрашивания пропорциональны содержанию данного компонента в смеси. Рис. 24. Тонкослойная хроматография. Тонкослойная хроматография, простая в исполнении, доступная и надёжная, включена в качестве стандартного метода анализа лекарственных препаратов в Государственную фармакопею России. Наряду с тонкослойной хроматографией используется близкая к ней по технике исполнения бумажная хроматография. В бумажной хроматографии в качестве твёрдого носителя используется особая хроматографическая бумага, отличающаяся однородностью состава и ориентации целлюлозных волокон. Неподвижной фазой в этом случае служит или сама бумага, или адсорбированная ею вода. По механизму разделения веществ различают адсорбционную, распределительную, ионообменную, молекулярно-ситовую и биоспецифическую хроматографию. В адсорбционной хроматографии в основе разделения веществ лежат их различия в адсорбционной способности на твёрдом адсорбенте. В распределительной хроматографии разделяемые вещества по-разному распределяются между подвижной (газовой или жидкой) фазой и неподвижной фазой, нанесенной на твёрдый носитель. В ионообменной хроматографии разделяются ионы из-за их различной склонности к ионному обмену между раствором и ионитом. Методом ионной хроматографии определяют очень многие анионы в питьевой и технической воде, в пищевой, фармацевтической и других отраслях промышленности. Описаны методики определения свыше 70 анионов неорганических и органических кислот, в том числе галогенидов, нитрита, нитрата, сульфата, ацетата. Число определяемых катионов значительно меньше это главным образом катионы щелочных и щелочноземельных металлов, а также органические катионы замещённых солей аммония. Количество миллиэквивалентов ионов, который можно обменять с помощью 1 г сухого ионита, называется обменной ёмкостью. Для большинства промышленных ионитов обменная ёмкость составляет 2-10 мэкв/г. Ионная хроматография успешно применяется в анализе объектов окружающей среды (атмосферы, воды и т.д.), в клинических исследованиях и многих отраслях промышленности. В молекулярно-ситовой хроматографии (гель-хроматографии) разделение веществ основано на различии в размерах их частиц. В качестве неподвижной фазы используют твёрдые тела, имеющие поры строго определённого размера. Они могут удерживать частицы, способные проникнуть в поры, но безразличны к частицам большего размера. В проникающей или эксклюзионной хроматографии подвижной фазой является растворитель (жидкость), а неподвижной та же жидкость, заполнившая поры сорбента (геля), т.е. и подвижную, и неподвижную фазы составляет одно и то же вещество или одна и та же смесь веществ. Гель готовят на основе декстрана, полиакриламида или других природных и синтетических соединений. Способность молекул анализируемого вещества проникать в растворитель, поглощённый частицами набухшего геля, зависит от степени пористости частиц геля и от размера молекул соединения. Распределение веществ на колонке, заполненной набухшим гелем, зависит от общего объёма растворителя внутри и снаружи частиц геля. Проникающая (эксклюзионная) хроматография используется для очистки высокомолекулярных биологических соединений. Так проводят очистку и разделение вирусов, белков, ферментов, гормонов, антител, нуклеиновых кислот и полисахаридов. Этим методом можно отделять аминокислоты от пептидов, фракционировать пептиды, образующиеся в результате гидролиза белков, а также олигонуклеотиды из гидролизатов нуклеиновых кислот. Метод проникающей хроматографии позволяет определять молекулярные массы неизвестных белков, концентрировать растворы белков, моносахариды отделять от полисахаридов и аминокислоты от белков. С помощью этого вида хроматографии в Институте вирусологии в Москве в 1990 году был выделен вирус СПИДа. В биоспецифической (аффинной) хроматографии используется уникальная способность некоторых биологических субстратов избирательно взаимодействовать с определёнными веществами, например, фермента с субстратом, антигена с антителом и др. Иначе говоря, аффинная хроматография основана на исключительной способности биологически активных веществ связывать специфически и обратимо другие вещества. В процессе связывания реализуется так называемый принцип молекулярного распознавания: фермент узнает свой субстрат, антиген антитело, гормон рецептор. Процесс разделения веществ с использованием аффинной хроматографии включает несколько самостоятельных этапов. Хроматографическую колонку заполняют носителем, ковалентно связанным с каким-либо биологически активным веществом (лигандом). Лигандами могут служить самые различные соединения: белки, пептиды, аминокислоты, витамины, нуклеотиды, нуклеиновые кислоты, углеводы и многие другие вещества. В качестве носителей в аффинной хроматографии получили широкое распространение гранулированные гели агарозы и полиакриламида (биогель P), полистирольные смолы с химически активными группами, целлюлоза и её производные и т.д. Затем через колонку пропускают анализируемую смесь веществ, к одному из которых иммобилизованный лиганд обладает биологическим сродством. Выбирая из смеси требуемое соединение, лиганд образует с ним комплекс. Остальные компоненты пройдут через колонку, не задерживаясь. Специфически адсорбированный компонент может быть освобожден из комплекса изменением природы элюента, pH или ионной силы. Различные варианты хроматографии широко применяются в медицине. Качественный и количественный анализ крови и мочи, экспрессный метод определения алкоголя, наркотиков, допинга. Количественное соотношение жирных кислот в физиологических средах, определённое хроматографически, позволяет диагностировать заболевания жёлчного пузыря, печени, сахарный диабет, нарушения сердечной деятельности и другие болезни. Хроматографический анализ незаменим при разработке новых лекарственных средств и для контроля качества промышленно выпускаемых препаратов. жүктеу/скачать 1,06 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|