Антитело - сыворотка больного. Свежую сыворотку перед опытом
инактивируют, чтобы разрушить имеющийся в ней комплемент. Для этого ее
прогревают 30 мин при 56° С на водяной бане или в инактиваторе с
терморегулятором. Последний способ предпочтительнее: он исключает
возможность перегрева сыворотки, т. е. ее денатурации. Денатурированные
сыворотки не пригодны для опыта. Сыворотку больного обычно применяют в
разведении от 1:10 до 1:160.
Иммунные сыворотки чаще всего готовят в производственных условиях и
выпускают инактивированными. Их разводят 1:50 и выше.
Внимание! Все компоненты готовят с небольшим избытком.
Проведение основного опыта
При постановке опыта крайне важна последовательность добавления
компонентов. Опыт проводят в две фазы (табл. 22).
Таблица 22. Схема основного опыта РСК
1
(
В опыте сыворотку можно изучать в последовательных двукратных разведениях.
)
Фаза I. В пробирки наливают требуемое количество изотонического
раствора натрия хлорида, затем - требуемый объем разведенной сыворотки и в
таком же объеме рабочие дозы антигена и комплемента. Опыт обязательно
сопровождают контролем всех участвующих в нем ингредиентов: сыворотки,
антигена, гемолитической системы и комплемента.
Пробирки тщательно встряхивают и инкубируют при 37° С 45 мин - 1 ч или
при 4° С ("РСК на холоде") 18 ч. За это время при наличии специфического
комплекса происходит связывание комплемента. Проведение реакции "на
холоде" значительно повышает ее чувствительность и специфичность.
Фаза II. По окончании инкубации во все пробирки добавляют по 1 мл
гемолитической системы, которую предварительно выдерживают в термостате
30 мин (сенсибилизируют). Пробирки встряхивают и снова ставят в термостат.
Учет результатов. Пробирки оставляют в термостате до полного гемолиза в
2, 3, 6 и 7-й пробирках (контроль сыворотки, антигена и комплемента на одну
и две дозы). Раньше всего гемолиз наступит в 7-й пробирке, в которой
находится двойное количество комплемента. После того как в этой пробирке
произойдет гемолиз и содержимое ее станет совершенно прозрачным, нужно
особенно внимательно следить за остальными контролями. Как только
жидкость в 2, 3 и 6-й пробирках станет прозрачной, следует немедленно
вынуть штатив с пробирками из термостата. О том, что опыт не задержали в
термостате дольше, чем нужно, говорит наличие легкой мути (неполного
гемолиза) в 5-й пробирке - в ней находится только половина рабочей дозы
комплемента и полного гемолиза при правильной постановке опыта быть не
может.
Гемолиз в контроле сыворотки и антигена (пробирки 2 и 3) указывает на то,
что дозы их были выбраны правильно и что сами по себе ни сыворотка, ни
антиген комплемент не связывают.
В контроле гемолитической системы (пробирка 4) при ее правильной работе
не должно быть даже следов гемолиза - в ней отсутствует комплемент.
Убедившись в том, что контроли прошли правильно, можно учитывать
опыт. Отсутствие гемолиза в пробирках опыта расценивают как
положительный результат реакции. Он свидетельствует о том, что в сыворотке
есть антитела, специфичные в отношении взятого антигена. Образованный
ими комплекс связал комплемент и воспрепятствовал его участию в реакции
гемолиза. Если в опытных пробирках наступит гемолиз, результат реакции
оценивают как отрицательный. В данном случае нет соответствия между
антигеном и антителом, комплемент не связан и участвует в реакции гемолиза.
Параллельно с сывороткой больного ставят такой же опыт с заведомо
положительной сывороткой (т. е. с сывороткой, в которой есть антитела к
данному антигену) и заведомо отрицательной, в которой нет специфических
антител. При правильной постановке опыта в первом случае должна быть
задержка гемолиза, а во втором случае будет гемолиз.
Интенсивность реакции выражают следующим образом:
++++ полная задержка гемолиза. Эритроциты образуют равномерную муть
или оседают на дно. В этом случае жидкость в пробирке становится
бесцветной;
+++ лизировано примерно 25% эритроцитов. Осадок меньше, жидкость над
ним слегка розовая. Результат РСК также оценивают как резко
положительный;
++ лизировано примерно 50% эритроцитов. Осадок небольшой, жидкость
розовая. Положительный результат РСК;
+ лизировано примерно 75% эритроцитов. Незначительный осадок, над ним
интенсивно окрашенная жидкость. Сомнительный результат РСК;
-
лизированы все эритроциты. Жидкость интенсивно окрашена и
совершенно прозрачна. Отрицательный результат РСК.
Достарыңызбен бөлісу: |