Методы стерилизации при проведении работ с культурой изолированных клеток и тканей растений
жүктеу/скачать 250,5 Kb.
|
- Бұл бет үшін навигация:
- Т а б л и ц а 2. Среда Мурасиге-Скуга
- Мезоинозит
- PH 5,6 ― 5,8
| Ход работы. Приготовить 100 мл питательной среды Мурасиге-Скуга (MC). Состав питательной среды приведен в табл.2.
Прежде всего необходимо приготовить маточные растворы макро-, микросолей, хелата железа (раствор FeSO и NA2 ЭДТА, необходимый для образования хелата железа следует нагреть до кипения). Полученные маточные растворы сливают в емкости с притертой пробкой (хелат железа – в темной посуде), снабжают этикеткой и хранят в холодильнике при температуре 4оС не больше месяца. Для приготовления концентрированных растворов витаминов берут 10-кратные навески и растворяют их в 10 мл воды; 1 мл содержит порцию витаминов, необходимую для приготовления 1л питательной среды по прописи Мурасиге-Скуга. Хранят растворы во флакончиках из-под пенициллина в замороженном состоянии. Т а б л и ц а 2. Среда Мурасиге-Скуга
Т а б л и ц а 3. Среда Уайта
Т а б л и ц а 4. Среда Гамборга и Эвелега (В5)
Растворы фитогормонов готовят следующим образом: 1) берут по 10 или 100 мг ауксинов (2,4-Д, ИУК, ИМК, НУК) и абсцизовой кислоты (АБК), растворяют в небольшом количестве этанола; 2) цитокинины (кинетин, зеатин, 2-ip, аденин, 6-БАП) растворяют в небольшом количестве 0,5 н. НСl или КОН. Затем в растворы добавляют дистиллированную воду до объема 100 мл (1мл содержит 0,1 или 1,0 мг гормона). На основе маточных растворов готовят питательную среду MС. Т а б л и ц а 5. Состав питательной среды Мурасиге-Скуга
В химический стакан емкостью 250 мл помещают 3 г сахарозы, доливают дистиллированную воду примерно до 30 мл и после растворения сахарозы добавляют 10мл маточного раствора макросолей, 1мл микросолей, 1мл витаминов, 0,5 хелата железа. Доводят в мерном цилиндре объем раствора до 100 мл. Необходимо обязательно измерить рН раствора, который устанавливают на уровне 5,6 – 5,8, используя 0,1н. КОН или 0,1%-ный раствор НСl .В предварительно нагретую среду (60 – 70оС) добавляют 0,7 грамма агара и доводят до кипения периодически помешивая. Горячую питательную среду разливают в пробирки примерно до 1/3 объема, закрывают ватно-марлевыми пробками или алюминиевой фольгой и стерилизуют в автоклаве. Р а б о т а 4. КУЛЬТУРА КАЛЛУСНОЙ ТКАНИ Материалы и оборудование. Стерильное растение картофеля в пробирке, стерильный пинцет и скальпель, стерильные бумажные "матрасики", газовая горелка или спиртовка, спирт, маточные растворы для приготовления среды Мурасиге-Скуга, растворы 2,4-Д и 6-БАП (1 мг/л), чашки Петри, колбы Эрленмейера на 100 мл, мерный цилиндр, пипетки. Объяснение. В ответ на ранение паренхимные клетки, расположенные под эпидермисом, дедифференцируются, переходят к делению и образуют недифференцируемую ткань, получившую название каллуса. Образование и рост каллуса регулируется ауксинами и цитокининами. Успех получения каллусной ткани в большой мере зависит от удачного подбора регулятора роста. В настоящее время каллусные культуры индуцируются практически из любого органа ткани или растения. Ход работы. Работа выполняется в четырех вариантах. Различие вариантов обусловлено содержанием фитогормонов в питательных средах, приготовленных на основе среды Мурасиге-Скуга. В каждую из четырех колб Эрленмейера на 50 мл прилить небольшое количество дистиллированной воды и следующие маточные растворы: 5 мл макросолей; 0,5 мл микросолей; 0,25 мл хелата железа; 1,0 мл витаминов; 5,0 мл мезоинозита. Затем в каждую колбу добавить 3 г сахарозы. После этого в три колбы добавляют по одному из следующих фитогормонов: 2,4-Д (1мл/л), 6-БАП (1мл/л), 2,4-Д + 6-БАП. В четвертую колбу фитогормоны не добавляют (контроль). Полученные растворы переливают в мерные цилиндры и доводят объем до 50 мл, рН – до 5,6 – 5,8, используя 0,1н. КОН. Затем добавляют агар-агар (по 0,4 г на каждый вариант среды) и в колбах автоклавируют среду. Р а б о т а 5. ПОЛУЧЕНИЕ И КУЛЬТИВИРОВАНИЕ КАЛЛУСА ИЗ РАЗЛИЧНЫХ ЭКСПЛАНТОВ КАРТОФЕЛЯ Материалы и оборудование: стерильное растение картофеля в пробирке, стерильный пинцет и скальпель, стерильные бумажные "матрасики" и чашки Петри, спиртовка, спирт, стерильная питательная среда для получения и культивирования каллуса картофеля в колбе или пробирке, парафилм, ножницы, спички. Объяснение. Каллус – это неорганизованная масса ткани, состоящая из дедифференцированных клеток. Образование и рост каллусной ткани контролируются фитогормонами из группы ауксинов и цитокининов. Под действием ауксинов и цитокининов из-за высокой интенсивности клеточных делений не происходит дифференцировка тканей, в результате чего образуется каллус. Для индукции каллусообразования используются питательные среды с высоким соотношением ауксинов к цитокининам (до 10:1). Каллусную ткань можно получить на искусственных питательных средах, включающих фитогормоны, используя фрагменты (экспланты) самых разных частей растений: стеблей, корней, тканей клубня, листьев, зародышей и др. Ход работы. Пробирки с растениями протереть спиртом, горлышко обжечь. Пинцетом вынуть стерильное растение из пробирки и выложить его на стерильный бумажный "матрасик". Придерживая растение пинцетом, вырезать скальпелем участки стебля длиной 5–10мм, листочки, участки корня. Надсечь экспланты острым скальпелем в нескольких местах, в которых в дальнейшем начнется каллусогенез. Нагреть стерильную питательную среду на плитке до расплавления агара. Одновременно подготовить ламинар-бокс к работе (протереть изнутри спиртом). Открыть колбу с питательной средой, обжечь ее горлышко над пламенем спиртовки и в стерильные чашки Петри разлить среду по 15–30мл. Чашки держать открытыми минимальное время. Дать среде застыть (10–15 минут). Надсеченные экспланты разместить на поверхности застывшей питательной среды, чуть вдавливая их пинцетом для усиления контакта со средой. В одну чашку помещают 10–20 эксплантов. Закрыть чашку Петри и заклеить парафилмом в два слоя. Парафилм следует равномерно натягивать для предотвращения разрывов при его усыхании. Поставить чашки Петри в термостат без освещения при температуре 22–25оС и влажности 70%. Через три недели рассмотреть и зарисовать образовавшийся каллус. жүктеу/скачать 250,5 Kb. Достарыңызбен бөлісу:
| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||