Методы стерилизации при проведении работ с культурой изолированных клеток и тканей растений

жүктеу/скачать 250,5 Kb.

бет	7/7
Дата	09.12.2023
өлшемі	250,5 Kb.
	#135478
түрі	Методические указания

1 2 3 4 5 6 7

Байланысты:
Сельскохозяйственная битехнология

Объяснение. Клональное микроразмножение – это разновидность вегетативного размножения, осуществляемого в культуре in vitro. В настоящее время большое число видов растений выращивается in vitro по следующим соображениям:
- для поддержания и размножения небольшого числа ценных генотипов;
- для ускоренного размножения новых ценных сортов плодовых и декоративных культур;
- для получения большого количества оздоровленного посадочного материала;
- для быстрого размножения некоторых гетерозиготных садовых форм, обычно размножаемых семенами;
- для получения из клонированных родительских форм семян гибридов F₁.
Клональное микроразмножение включает в себя следующие этапы:
1) введение в культуру in vitro;
2) пролиферация побегов или собственно микроразмножение;
3) укоренение и акклиматизация побегов in vivo.
Ход работы. С маточных растений заготавливаются активно растущие побеги длиной 5 – 10 см и переносятся в лабораторию. Все листья удаляются. Для стерилизации используется 3 – 9 %-ный (в зависимости от чистоты материала) раствор гипохлорита кальция. Для лучшего смачивания тканей экспланта стерилизующим раствором следует использовать детергент Твин-20 (1капля на каждые 50 мл).
В 200 – 250 мл стерилизующего раствора помещаются экспланты и перемешиваются на магнитной мешалке в течение 20 – 30 минут. В условиях ламинар-бокса экспланты отмываются в стерильной воде 3 – 4 раза для удаления остатков антисептика. С помощью пинцета экспланты по 2 – 5 шт. помещаются на стерильные бумажные "матрасики", после чего с помощью скальпеля удаляются 0,5 – 1,0 см поврежденной ткани. Побеги разрезаются на экспланты длиной 2 – 4 см и помещаются на питательную среду. Для культивирования на первом этапе микроразмножения используются только пробирки, поскольку в этом случае удается избежать перезаражения эксплантов. Культивирование эксплантов осуществляется в культуральной комнате при длине дня 16 часов, освещенности 1 – 6000 люкс, температуре 25 – 27⁰С в течение 3 – 4 недель. После окончания культивирования инфицированные экспланты удаляются, оставшиеся используются для переноса на второй этап. Как правило, после прохождения первого этапа из пазушных почек и непосредственно из каллуса, который часто образуется в нижней части экспланта, формируются пазушные и придаточные (адвентивные) побеги, которые используются как экспланты для переноса на второй этап. Культивирование на втором этапе осуществляется в банках или колбах объемом 300 – 500 мл. В течение культивирования на втором этапе (6 – 8 недель) экспланты формируют новые побеги, которые, в свою очередь, могут быть использованы для размножения (пересадка на второй или последующие пассажи) или для укоренения.
Укоренение микропобегов осуществляется на питательной среде с ауксинами. Для укоренения используются микропобеги длиной 2 см и более, которые помещаются вертикально на агаризованную питательную среду. В течение 3 – 4 недель в нижней части микропобегов формируется каллус, из которого образуются первичные корешки. Акклиматизация микрорастений осуществляется в смеси торфа (рН 5.5 – 6.0) с песком или перлитом в соотношении 3:1 с использованием туманообразующей установки или в теплице. В случае появления очагов инфекции на растениях или субстрате следует произвести обработку раствором фунгицида. После прохождения периода акклиматизации и укоренения in vivo (3 – 4 недели) микрорастения пикируются в горшки с субстратом и доращиваются в пленочной теплице до реализации или высадки в открытый грунт.
В отдельных случаях укоренение микропобегов может осуществляться в не стерильных условиях. В качестве вещества, индуцирующего ризогенез, используется ростовая пудра на основе ИУК или ИМК. Микропобеги размером 2 см и более отделяются друг от друга и помещаются в емкость с водой для предотвращения подсыхания. Затем нижний конец каждого обрабатывается ростовой пудрой и побеги помещаются в субстрат для укоренения. Укоренение происходит через 2-3 недели, если температура поддерживается в пределах 25 – 27^о, освещенность – 2000 – 3000 люкс, а поверхность листочков постоянно смачивается водой. Через 8-10 недель после постановки на укоренение микрорастения готовы для пикировки.
Таблица 7. Составы питательных сред.

№ п/п	Компаненты	Объемы смеси, мл
		1000		500		200		100
Для микроразмножения герберы
1	Макросоли MC	100 мл		50 мл		20 мл		10 мл
2	Микросоли МC	10 мл		5 мл		2 мл		1 мл
3	Fe-хелат	5 мл		2,5 мл		1 мл		0,5 мл
4	Витамины	10 мл		5 мл		2 мл		1 мл
5	Мезоинозит	100 мл		50 мл		20 мл		10 мл
6	Аденин	20 мл		10 мл		4 мл		2 мл
7	Кинетин	3 мл		1,5 мл		0,6 мл		0,3 мл
8	ИУК	0,1 мл		0,05 мл		0,02 мл		0,01 мл
9	Сахароза	30 г		15 г		6 г		3 г
10	рН	5,8		5,8		5,8		5,8
11	Агар	7 г		3,5 г		1,4 г		0,7 г
Для микроразмножения фикуса Бенджамина
1	Макросоли MC	100 мл		50 мл		20 мл		10 мл
2	Микросоли MC	10 мл		5 мл		2 мл		1 мл
3	Fe-хелат	5 мл		2,5 мл		1 мл.		0,5 мл
4	Витамины	10 мл		5 мл		2 мл		1 мл
5	Мезоинозит	100 мл		50 мл		20 мл		10 мл
6	2 ip	5 мл		2,5 мл		1 мл		0,5 мл
7	Сахароза	30 г		15 г		6 г		3 г
8	рН	5,6		5,6		5,6		5,6
9	Агар	7 г		3,5 г		1,4 г		0,7 г
Для микроразмножения лилий
1	Макросоли MC		100 мл.		50 мл.		20 мл.		10 мл.
2	Микросоли MC		10 мл.		5 мл.		2 мл.		1 мл.
3	Fe-хелат		5 мл.		2,5 мл.		1 мл.		0,5 мл.
4	Витамины		10 мл.		5 мл.		2 мл.		1 мл.
5	Мезоинозит		100 мл.		50 мл.		20 мл.		10 мл.
6	НУК		0,5 мл.		0,25 мл.		0,1 мл.		0,05 мл.
7	Сахароза		60 г.		30 г.		12 г.		6 г.
8	рН		5,8		5,8		5,8		5,8
9	Агар		7 г.		3,5 г.		1,4 г.		0,7 г.

Работа 11. Получение и культивирование

зернового мицелия вешенки обыкновенной

Материалы и оборудование: стерильный маточный мицелий ве-шенки обыкновенной, стерильные колбы на 500 мл, зерно злаков (овес, пшеница, рожь, ячмень), мел, весы, автоклав, электрическая плитка, ламинар-бокс, стерильные пинцет и скальпель.
Объяснение. Для того чтобы вырастить грибы в искусственных условиях, субстрат необходимо заинокулировать (заразить) мицелием. Зерновой мицелий представляет собой мицелий, выращиваемый стерильно на специально приготовленном зерне хлебных злаков. От качества мицелия, представляющего собой посевной материал для производства грибов, зависит их последующий выход. Поэтому мицелий должен соответствовать ряду основных требований: иметь высокую жизнеспособность; устойчивость к болезням и вредителям, принадлежать к отселектированному штамму (сорту), обладающему высокой урожайностью, хорошими товарными качествами и пр.
По сортовым качествам мицелий классифицируется на три категории: споровый, маточный, коммерческий.
споровый мицелий получается из спор, заготавливаемых из плодовых тел, соответствующих требованиям данного штамма. Культивируется на агазированной питательной среде с отваром зерна хлебных злаков.
Маточный мицелий получается путем инокуляции стерильного зернового субстрата споровым мицелием.
Коммерческий мицелий используется, как правило, для инокуляции субстрата на основе соломы для выращивания товарных грибов. Получается путем инокуляции стерильного зернового субстрата маточным мицелием в соотношении 1:(15–20).
Ход работы. Зерно хлебных злаков (0.5литра) отваривается в небольшом количестве воды в течение 15–30 мин, после чего вода сливается. Горячее зерно высыпается на поверхность стола, разравнивается тонким слоем для просыхания. Затем зерно засыпается в колбы на 0,5 л на 2/3 от полного объема, туда же добавляется мел в количестве 0,7 г (для оптимизации кислотности зернового субстрата). Колбы закрываются и слегка встряхиваются для перемешивания зерна и мела. Стерилизация осуществляется в автоклаве при температуре 125^оС в течение 30 мин. После охлаждения, колбы переносятся в ламинар-бокс, где производится инокуляция зернового субстрата маточным мицелием. Расход маточного мицелия 1:(15–20). После инокуляции и в процессе культивирования колбы периодически встряхиваются для равномерного распределения инокулята по всему объему зерна и ставят на зарастание (культивирование) в термостат. Культивирование осуществляется в течение 10–15 дней при температуре 25^оС до полного зарастания зернового субстрата. После зарастания коммерческий мицелий используется для инокуляции соломистых субстратов с целью получения товарных грибов.
Литература

А р т а м о н о в В.И. Биотехнология – агропромышленному комплексу. М.: Наука, 1989. 160 с.
Биотехнология растений: культура клеток / Перевод с анг. В.И. Негрука. М.: Агропромиздат, 1989. 280 с.
Биотехнология. Учебное пособие для вузов. В 8 кн. / Под ред. Н.С. Егорова, В.Н. Самуилова. Кн. 1: Проблемы и перспективы. М.: Высшая школа, 1987. 159 с.
Биотехнология. Учебное пособие для вузов. В 8 кн. / Под ред. Н.С. Егорова, В.Н. Самуилова. Кн. 3: Клеточная инженерия М.: Высшая школа, 1987. 127 с.
Б у т е н к о Р.Г. Культура клеток растений и биотехнология. М.: Наука, 1986.
Г л е б а Ю.Ю., С ы т н и к К.М. Клеточная инженерия растений, Киев: Наук. думка. 1984.
К а р т е л ь Н.А. Биоинженерия: методы и возможности. Мн.: Ураджай, 1989. 143с.
К а р т е л ь Н.А., Л о б а н о к Е.В., Ф о м и ч ё в а В.В. Фитогормоны и фитопатогенность бактерий. Мн: Навука i тэхнiка, 1994. 110 с.
П о л е в о й В.В. Физиология растений: Учебник для биотехнологических специальностей вузов. М.: Высшая школа, 1989. 464 с.
Сельскохозяйственная биотехнология / В.С. Шевелуха, С.В. Дегтярёв, Г.М. Артамонова и др. М.: Изд-во МСХА, 1995. 310 с.
Основы химической регуляции роста и продуктивности растений / Муромцев Г.С., Чкаников Д.И., Кулаева О.Н., Гамбург К.З. М.: Агропромиздат, 1987. 383 с.
Х р и п а ч В.А., Ж а б и н с к и й В.Н., Л а х в и ч Ф.А. Брассиностероиды. Мн.: Навука i тэхнiка, 1993. 287 с.

СОДЕРЖАНИЕ
стр.
Работа 1. Изучение методов стерилизации при работе с культурой изолированных клеток и тканей. . . . . . . . . . . 3
Работа 2. Определение различий в способе действия регуляторов роста растений на прорастание семян озимой пшеницы. . . . . . 6
Работа 3. Приготовление питательных сред для культивирования изолирован-ных клеток и тканей растений. . . . . . . . . 7
Работа 4. Культура каллусной ткани. . . . . . . . . . . . . 12
Работа 5. Получение и культивирование каллуса из различных эксплантов картофеля. . . . . . . . . . . . . . . 12
Работа 6. Пассирование каллусной ткани на свежую питательную среду. 14
Работа 7. Культивирование изолированных зародышей (эмбриокультура) ози-мой ржи. . . . . . . . . . . . . . 14

Работа 8. Вычленение и культивирование апикальных меристем картофеля. 15

Работа 9. Клональное микроразмножение картофеля черенкованием побегов 17
Работа 10. Микроразмножение плодовых, ягодных и декоративных растений 18
Работа 11. Получение и культивирование зернового мицелия вешенки обыкновенной. . . . . . . . . . . . . 21
Литература. . . . . . . . . . . . . . . . . 23

У ч е б н о – м е т о д и ч е с к о е и з д а н и е

К о л л е к т и в с о с т а в и т е л е й

СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ

Методические указания к лабораторно-практическим занятиям

Редактор Е.Г. Бутова

Техн. редактор Н.К. Шапрунова
Корректор Е.В. Ковалева
Подписано в печать .
Формат 60х84¹/₁₆. Бумага для множительных аппаратов.
Печать ризографическая. Гарнитура "Таймс".
Усл. печ. л. 1,39. Уч. – изд. л. 1,30.
Тираж 100 экз. Заказ Цена 320 руб.
Редакционно-издательский отдел БСХА
213410, г. Горки Могилевской обл., ул. Студенческая, 2
Отпечатано на ризографе лаборатории множительных аппаратов БСХА
г. Горки, ул. Мичурина, 5

жүктеу/скачать 250,5 Kb.

Достарыңызбен бөлісу:

1 2 3 4 5 6 7