Кенжебаева Сəуле Сағындыққызы биотехнологиядағЫ Қазіргі əдістер
жүктеу/скачать 5,04 Mb. Pdf көрінісі
|
Kenzhebayeva (1) (1) (1)
| Электрофорез түрлері. Олардың қысқаша сипаттамасы əртүрлі
түрімен төменде келтірілген. Жылжымалы шекарамен электрофорез U-сияқты төртбұрышты көлденең қимасы бар тік кюветада жүргізеді. Əдіс буферде белоктардың бөлінуіне жасалған. Əдістің негізгі кемшілігі – электрофорезде өткізілу уақытында сұйықтың конвекциясы ағындарының болуы. Еркін ортадағы аймақтық электрофорез электрофорез түтігінің айналу есебінен немесе жұқа қабаттағы сұйықтағы электрофорез өткізу есебінен конвекция ағындар шығарады. Тығыздықтың градиентіндегі аймақтық электрофорез қант, гли- церин, этиленгликоль ауыр су жəне т.б. тығыздығының градиентінде 95 электрофорез белокты аймақтардың тұрақтануына өткізу есебінен жасалған. Капилляр құрылымы бар қолдайтын ортадағы аймақтық электро- форез бөліну жүргізілетін, капиллярлық құрылым құрастырылатын заттарды ортаға белокты аймақтардың тұрақтануы үшін сүзгі (қағаз сүзгі, полисахаридтің сірке қышқылы тұзы, бағанның қабыршақтары немесе целлюлоза ұнтағының жиынтықтары, түйіршіктелген күрделі көмірсу, агар, агароза, крахмалды немесе полиакриламидті гельдер) енгізіледі. Қағаз сүзгідегі электрофорез қағаз сүзгінің жолақтары ретінде қызмет көрсететін, қолдайтын ортада жүргізіледі. Полисахаридтің сірке қышқылы тұзындағы электрофорез поли- сахаридтің сірке қышқылы тұзы жолағының қолдайтын ортасын пай- даланады. Түйіршіктелген қолдайтын орта бағандары мен жиынтықтарын- дағы электрофорез, негізінде, белокты қоспалардың препаративтік бөлінуі үшін қолданылады. Қолданылатын орта ретінде шыны неме- се (поливинилхлорид) пластмасса ұнтақтары, түйіршіктелген күрделі көмірсу, целлюлоза ұнтағы, сонымен бірге сефадекс немесе агароза қолданылады. Агар жəне агароза гелъдеріндегі электрофорез жоғарыда аталған кеуекті гельдер қолдайтын орта ретінде пайдаланылады. Крахмалды гельдердегі электрофорез картоп жəне күріш күрделі көмірсудың қолдайтын ортасы ретінде қолданылады. Полиакриламидті гельдегі электрофорез (ПААГ) – қазіргі уақытта аналитикалық жəне препаративті электрофорездің кең қолданылатын түрі. Бұл əдіс акриламид жəне бисакриламидтің сополимер қолдайтын ортасы ретінде жүргізіледі. Изоэлектрлік фокустеу – макромолекулалар бөлінуінің өте жаңа əдістерінің бірі. Изоэлектрлік фокустеу кезінде анод пен катод арасын- да рН градиенті жасалады. Бастапқыда ортада бірқалыпты бөлінген немесе осы ортада бір жолақ түрінде енгізілген зарядталған молеку- лалар қарама-қарсы зарядталған электрод олардың нақты зарядымен сəйкес бағытында жылжиды. Егер бұл молекулалар амфотерлі болса, яғни қоршаған рН-қа сəйкес, əртүрлі электрлік зарядты топтарда бол- са, онда жасанды құрастырылған рН градиентінде орын ауыстыру- ында олардың жиынтық заряды рН соған дейін өзгеріп, ол тең нөлге болған жағдайға жетпейді. Бұл рН мəн молекуланың электр нүктесіне беріспейтін рН градиенті сол орында болады. 96 Изотахофорез – барлық зарядталған молекулалар бірдей (изо) жылдамдықпен (тахо) электр өрісінде жылжитын электрофорез түрі. Белоктарды жəне пептидтерді бөлекшелеу үшін бұл əдіс қазіргі молекулалы биологияда, биохимияда, генетикада кең қолданылады. Казіргі кезде əртүрлі мақсатқа жəне əртүрлі белоктар мен пептидтер- ге полиакриламидті гель (ПААГ) белоктардың электрофорезінің көп түрлендіруін өңдеуге болады. Электрофорездің ең көп таралған түрі – Лэммли бойынша натрий додецилсульфаты (ДСН) қатынасуымен полиакриламидті гельдегі (ПААГ) белоктардың электрофорез (ағылш. тілінен SDS-РАGЕ) əдісі. 2.7-сурет. Натрий додецилсульфаты қатынасуымен полиакриламидті гельдегі (ПААГ) электрофорездің жобасы (http://yanko.lib.ru/books/biolog/nagl_biochem/84.htm) 97 Электрофорез кезінде молекулалардың қозғалу жылдамдығы тал- данатын белоктық қоспасы негізгі үш қасиетімен: молекулалардың мөлшерімен, пішінімен жəне жиынтық зарядпен анықталады. Сондықтан бастапқы кезде белоктарды денатурациялау керек, сон- да молекулалардың қозғалу жылдамдығы тек қана молекуланың мөлшеріне байланысты болады. Осы себептерге байланысты натрий додецилсульфаты детергент бойынша талданатын белоктық қоспаны осы белоктың қоспаны осы қосындымен өңдеу керек. Натрий додецил- сульфаты – өте жоғары амфифилді қасиеттері бар детергент. ДСН (SDS) əсерінен олигомерлік белоктар суббірлікте диссоциацияланады жəне денатурацияланады. Жайылған полипептидті тізбектер ДСН (0,4 г/п белок үлгісі) байланысады жəне теріс зарядқа айналады. Белоктарды толық денатурациялау үшін электрофорез жүргізілетін ортаға тиолдар- ды, мысалы, 2-меркаптоэтанолды, дисульфидті көпірлерде ыдырайтын қосындыларды қосады. Электрофорезге арналған полиакриламидтің жұқа қабаты табақшада жүргізіледі. Электрофорез аяқталған соң, бөлінген белоктардың аймақтарын бояулардың көмегімен анықтайды (2.7-сурет). Электрофорезге арналған негізгі əдістің сатылары 2.7-суретте көрсетілген. Бояулармен, көбінесе Кумасси бояу (Coomassie blue) неме- се AgNO3 ерітіндімен өңдеуден кейін полиакриламидті табақшаны бо- яйды. Боялған гельде əртүрлі молекулалық мөлшері бар сызық сияқты белоктар көрінеді (2.8-сурет). 2.8-сурет. Молекуларлық салмағына байланысты электрофорез арқылы белоктарды бөлудің полиакриламидті гельдің безендіретін көрінісі. Сол жақта – əртүрлі белгілі молекулалық массасымен белоктардың молекулалық маркерлері (http://ru.wikipedia.org/wiki) 98 Полиакриламидті гельде (ПААГ) белоктардың электрофорезін жүргізгенде буферлік ерітінді ретінде трис-НСl, трис-глицин, ТВЕ, мо- чевина мен ТВЕ, вис-трис пайдаланылады. Вестерн блоттинг əдісінің зерттеулері бөлінген белоктарды поли- акриламидті гельден нитроцеллюлозды мембранаға көшіреді. жүктеу/скачать 5,04 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|