Репликация днк: учебное пособие
жүктеу/скачать 2,57 Mb. Pdf көрінісі
|
|
5.5. Теломеры и репарация Теломеры являются единственными «легально разрешенными» двунитевыми разры- вами ДНК в клетке. Двунитевые разрывы ДНК (DSBs, double-strand breaks) возникают под действием ионизирующей радиации и некоторых других повреждающих агентов. Известны два оснв- ных пути репарации DSBs: гомологическая рекомбинация и достраивание недостающих нитей, и негомологичное соединение концов ДНК (NHEJ, Non-homologous end joining). Счи- тают, что первый путь преобладает в S и G2 фазах клеточного цикла и в активно делящихся клетках, например дрожжей, а второй – в G0/G1 фазах и в редко делящихся клетках, в част- ности клетках млекопитающих. С другой стороны, показано, что разрывы геномной ДНК могут активно стимулировать гомологичную рекомбинацию в клетках млекопитающих. Независимо от механизмов репарации, и DSBs, и незащищенные теломеры активи- руют протеинкиназу АТМ (ataxia-telangiectasia mutated), что приводит, как уже отмечалось ранее, к активации р53 и далее – к остановке пролиферации и индукции механизмов клеточ- ного старения или апоптоза. При образовании t-петли, однонитевой участок теломер, спа- ривающийся со «стволом», имитирует гомологичную рекомбинацию и при определенных условиях может стимулировать достраивание новой цепи ДНК. По этому принципу проис- ходит удлинение теломер, независимое от теломеразы. В составе теломерного нуклеопротеидного комплекса как у дрожжей, так и в клетках человека постоянно присутствует белок Кu, один из компонентов NHEJ. Гетеродимер Кu человека состоит из субъединиц молекулярной массой 69 и 83 кДа, называемых Кu70 и Кu80 (или Кu86). У дрожжей гомологичные белки называются HDF1 (или yКu70) и НDF2 (соот- ветственно, уКu80). Этот гетеродимер связывает как одно-, так и двунитевые разрывы ДНК не только в области теломер, но и в любой другой части хромосомы, и предположительно препятствует дальнейшей деградации порежденого участка ДНК. Участие Кu в функционировании теломер изучается не столь давно, но его присутствие в области телосомы неоднократно отмечалось в разных лабораториях. Противоречие между ролью Кu в репарации DSВs и участием этого белка в защите теломер, в том числе, от слия- ний, достаточно очевидно, поскольку это два прямо противоположных процесса. Вероятно, Кu выполняет во всех случаях лишь защитные функции, а дальнейшие процессы происхо- дят при участии специфических для них белков, т. е. либо TRF, либо систем репарации и рекомбинации. В частности, на теломерах Кu ингибирует деградацию и рекомбинацию тело- мерных повторов. При недостатке этого белка теломеры укорачиваются; в участках генома, прилегающих к концам хромосом, активность которых в норме подавлена, инициируются перестановки последовательностей. К сожалению, единого мнения по вопросу о роли белка Кu в телосоме пока нет. После связывания белка Кu на DSВ и активации DNА-РК в репарации участвует еще множество белков. Среди них комплекс Rad50/Mre11/NBS1. Кроме NHEJ эти белки участ- вуют также в гомологичной рекомбинации и в поддержании целостности теломер. Белок Rad50 (Radiation mutant 50) первоначально изучали на дрожжах, однако в 90-е гг. был найден его гомолог и у человека. Rad50 – вытянутая палочкообразная молекула, напо- минающая по форме миозин. Молекулярная масса ортологов у дрожжей и человека – 153 кДа. Полипептид имеет два ДНК-связываюших домена, расположенных на N– и С-концах молекулы и проявляющих ферментативную АТРазную активность. Это наиболее консерва- тивные по аминокислотной последовательности участки молекулы, идентичные у дрожжей и человека на 50 % и более. Энзиматические домены соединены протяженным суперспира- лизованным участком, изогнутым под острым углом в районе Zn-связываюшего мотива, рас- И. М. Спивак. «Репликация ДНК: учебное пособие» 71 положенного в центре молекулы, так что ДНК-связываюшие домены колокализованы. Zn- связываюший домен служит для димеризации белков Rad50, так что димер из двух палочко- видных молекул может одновременно удерживать молекулы ДНК, расположенные на рас- стоянии до 1200Å. Mre11 (meiotic recombination 11) – нуклеаза, которая также изучалась на дрожжах, и гомологи которой присутствуют во всех царствах, включая животных и чело- века. При репарации Mre11 подвергает деградации шпильки и прочие неправильные струк- туры в молекуле ДНК, в частности, образующиеся в районе поврежденных вилок реплика- ции. При гомологичной рекомбинации нуклеазная активность необходима для спаривания двух молекул ДНК, в котором участвуют 3'-концевые однонитевые участки протяженно- стью в несколько сотен пар нуклеотидов. Комплекс Rad50/Мге11, в котором Мге11 связы- вается в районе АТРазного домена Rad50, проявляет эндонуклеазную, а также экзонукле- азную активность в направлении от 3'– к 5'-концу ДНК, но не в обратном направлении. Очевидно, Мre11 – не единственная нуклеаза, участвующая в катализе рекомбинации. Неко- торые мутации Мre11, приводящие к блокированию взаимодействия с Rad50, сопровожда- ются укорочением теломер, не нарушая при этом процессы репарации; другие, напротив, снижают энзиматнческую активность белка, но не влияют на его участие в защите теломер. Следовательно, функции этого белка в репарации и в поддержании структуры теломер раз- личны. Третий компонент комплекса MRN у дрожжей и человека не гомологичен. У S.се- гevisеае это белок Хгs2 (X-ray sensitivity), а у человека – нибрин или Nbs1) (Nijmegen breakage syndrome 1), белок, мутация которого на клеточном уровне приводит к измене- ниям, сходным с вызванными мутацией АТМ, хотя клиническая картина соответствую- щего наследственного заболевания в двух указанных случаях различается. NBS1 имеет три сайта фосфорилирования и таким образом модулирует энзиматическую активность Rad50 и Мге11. В то же время он придает комплексу способность в присутствии АТР раскручивать двунитевуюДНК. |