Репликация днк: учебное пособие
Точка рестрикции клеточного цикла –
жүктеу/скачать 2,57 Mb. Pdf көрінісі
|
|
6.4. Точка рестрикции клеточного цикла – узел митогенных и ингибирующих сигналов Во время клеточного деления удваиваются и разделяются по двум дочерним клет- кам все молекулы и органеллы материнской клетки. Удвоение ДНК происходит только в фазе S. У всех эукариот имеются сходные белковые комплексы, участвующие в инициации репликации и сходные белки, разрешающие репликацию. После образования, компоненты этого комплекса активируются циклин-зависимыми киназами. Начавшись, репликация ДНК должна быть завершена. Таким образом, внеклеточные сигналы типа ростовых факторов не могут и не должны влиять на прохождение S-фазы. Так как S-фаза независима от росто- вых сигналов, то к ее остановке могут приводить только массивные повреждения ДНК или отсутствие пула нуклеотидов, но такой арест часто оканчивается гибелью клетки. После успешного завершения синтеза ДНК клетки переходят в G2-фазу и готовятся к митозу. Активированные в G2-фазе протеинкиназы предотвращают повторную репликацию. Покоящиеся клетки млекопитающих являются диплоидными, так что после удвоения ДНК они должны разделиться. То есть в G2-фазе контроль ростовых факторов также не нужен. Не нужны и свободные нуклеотиды, и остановить вступление клетки в митоз могут внутри- клеточные сигналы, генерируемые в ответ на повреждение ДНК. В процессе митоза циклин В-cdk1 фосфорилирует ламинин, белок ядерной мембраны, что приводит к растворению ядерной оболочки. В метафазе митоза конденсация хромо- сом совпадает с формированием митотического веретена. Эндоплазматический ретикулюм и комплекс Гольджи распадаются на маленькие пузырьки. Во время митоза хромосомы конденсированы, белки гиперфосфорилированы, а транскрипция и биосинтез резко огра- ничены или отсутствуют. Прохождение митоза определяется мониторингом функциони- рования микротрубочек, способствующих правильному расхождению хромосом. Внешний контроль ростовых факторов в такой момент представляется просто вредным, так что и митоз также является фазой цикла, независимой от них. В анафазе митоза две группы хромосом расходятся в разные стороны. Во время телофазы и цитотокинеза в клетке как бы в обратном порядке идет процесс восстановления внутриклеточных мембран. Вокруг ядер формируются оболочки, эндоплазматический ретикулум и комплекс Гольджи заново выстраиваются в цитоплазме. Микротрубочки разбираются. Транскрипция и биосинтез нормализуются, восстанавливаются внутриклеточные мембранные пути. После выхода из митоза клетки готовы к следующему клеточному циклу, допуская установление нового ком- петентного к репликации состояния в G1-фазе. Таким бразом, из простых логических умо- заключений следует, что только G1-фаза клеточного цикла может зависеть от ростовых фак- торов. Основные регуляторные события, приводящие к пролиферации, происходят в G1-фазе цикла. In vivo, так же, как и в клеточных культурах, большинство покоящихся клеток имеют количество ДНК, соответствующее таковому в G1. Рост нормальных клеток в культуре регу- лируется комплексом взаимодействий между факторами роста, плотностью клеток и сте- пенью их прикрепления к субстрату. Факторы роста необходимы для инициации и под- держания движения по фазе G1, приводящего к фазе S. Удаление ростовых факторов до определенного момента фазы G1 предотвращает наступление фазы S в нормальных клетках. Точка G1-фазы, после которой клетка не нуждается более в ростовых факторах для завер- шения клеточного цикла, была названа точкой рестрикции. Ее время было определено при- мерно за 2–3 ч до начала синтеза ДНК. Единожды в точке рестрикции или точке, после кото- рой нет пути назад, клетки настраиваются на синтез ДНК и в дальнейшем не нуждаются во внеклеточных ростовых факторах в течение всего клеточного цикла. Было высказано пред- И. М. Спивак. «Репликация ДНК: учебное пособие» 88 положение, что прохождение точки рестрикции, определяется накоплением особого лабиль- ного (короткоживущего) белка, который получил условное название «R-белок». Определение точки рестрикции могло бы быть маркером для различения нормальных и опухолевых клеток. Но какова ее биохимическая природа? Была высказана гипотеза, что R-белок является функциональным короткоживущим регуляторным белком, синтез которого чувствителен к ростовым факторам и который должен накопиться в достаточном количестве до того, как клетка пройдет точку рестрикции и двинется вперед, к синтезу ДНК. К моменту постановки этого вопроса еще не были известны онкогены и пути передачи клеточных сиг- налов. Многие из открываемых впоследствии белков анализировали с точки зрения крите- риев R-белка. Поиск экспрессирующегося только в поздней G1-фазе и отсутствующего в покоящихся клетках белка позволил предложить несколько различных вариантов. Выявление потенци- ального R-белка было сделано методом дифференциального дисплея. К сожалению, в том случае, если накопление белка происходит путем его стабилизации, а не повышения экс- прессии, данный метод не работает. R-белок является короткоживущим белком, который индуцируется, или стабилизиру- ется в ответ на действие ростовых факторов, причем накопление R-белка ведет к независи- мости от них. Открытие циклинов G1-фазы D и E было крайне важным. Циклин D1, корот- коживущий ядерный белок, накапливается под действием ростовых факторов. Он обычно сверхэкспрессирован в опухолевых клетках. То же с циклином Е, свойства которого отве- чают всем требованиям к R-белку, включая повышение в поздней G1, задержку появления после ингибирования синтеза белка в нетрансформированных клетках и быстрое восстанов- ление в трансформированных клетках. Движение по циклу осуществляется под действием Cdks. Их активаторы циклины нестабильны и их экспрессия циклична в течение клеточного цикла. Таким образом, именно наличие циклинов контролирует активность Cdks и играет ключевую роль в регуляции кле- точного цикла. За время прохождения клетки по циклу последовательно продуцируются четыре основных циклина – D, E, A, B. Циклин В ассоциирован с p34/cdk1 и является триг- гером митоза. Движение по S-фазе требует наличия циклина А и его ассоциации с р33/Cdk2. Циклины D и Е приводят клетку к S-фазе. Три типа циклина D: D1, D2, D3 очень похожи, но существенно отличаются от циклина Е. Во время клеточного цикла D-циклины начи- нают накапливаться в середине G1, в то время как циклин Е появляется позже, почти прямо перед переходом из G1 в S. Зависимое от митогенного сигнала продвижение по G1 связано с индукцией циклинов D-семейства. Факторы роста регулируют циклин D, как это показано на рис/32 четырьмя способами одновременно: 1) индукция транскрипции; 2) стабилизация белка циклина D; 3) перемещение в ядро; 4) объединение с их каталитическими партнерами Cdk-4 Cdk-6. Промоторы D-циклинов отвечают на большое число митогенно-активирующихся сиг- налов, таких как Ras и β-катенин-Tcf/lef.. Индукция транскрипции циклина D1 зависит от Ras/Raf-1/Mek/ERK сигнального пути. К тому же циклин D1 быстро деградирует и имеет короткое время существования. Важно подчеркнуть, что не только уровень циклинов D и Е, но и других белков, которые регулируют или осуществляют точку рестрикции, может повы- шаться путем стабилизации (как р53, обычно без специального фосфорилирования идущий путем протеосомной деградации). Подобным же образом протеосомной деградации под- вергаются ингибиторы Cdks р27 и р21, сам циклин Е и транскрипционный фактор Е2F-1. Циклин D1 подвергается убиквитинированию и протеосомной деградации после фосфори- лирования по треонину-286. Это фосфорилирование может быть ингибировано через сиг- И. М. Спивак. «Репликация ДНК: учебное пособие» 89 нальный путь, в котором частично задействованы Ras, Pi3-киназа и протеинкиназа В (Act). Такой оборот циклина D1 является митоген-зависимым, а перенос в ядро и ассоциация с Cdk4 – митоген-независимым. После объединения циклина D c Cdk в ядре, этот комплекс фосфорилирует белок Rb, нарушая его связывание с факторами транскрипции E2F, активирующими E2F-зависимую транскрипцию. Транскрипционный фактор E2F активирует транскрипцию генов, продукты которых вовлечены в ядерный метаболизм и синтез ДНК. Для понимания природы точки рестрикции нужно помнить, что E2F трансактивирует циклины Е и А. Циклин Е в комплексе с Cdk2 сотрудничает с циклин D – Cdk4/Cdk6 комплексами для полного фосфорилирования белка Rb. Циклин E-Cdk2 обладает более широкой активностью, чем циклин D-Cdk4/Cdk6. К примеру, циклин E-Cdk2 фосфорилирует ингибитор р27, что ведет к его деградации. Напро- тив, в низкой концентрации ингибиторы Cdks р21 и р27 коактивируют циклин D – Cdks. Другой класс ингибиторов р15, р16, р18 и р19 специально ингибируют циклин D – Cdks. Факторы роста активируют собственные рецепторы и другие тирозинкиназы, а через них Ras и митоген-активирующиеся сигнальные пути, кульминацией этого процесса явля- ется индукция транскрипции многочисленных генов, включая протоонкогены. Сходным образом, многие гены, кодирующие факторы роста, рецепторы, рецептор-ассоциированные белки и киназы сами являются протоонкогенами. Одним из важнейших загадок в понимании регуляции клеточного цикла является связь митогенной стимуляции с машиной клеточного цикла. Экспрессия циклина D, его продви- жение в ядро, стабилизация и ассоциация с Cdks4 или 6 в активный киназный комплекс регу- лируется ростовыми факторами. Следовательно, циклин D является сенсором ростовых фак- торов. Способность циклин D – зависимых киназ начинать фосфорилирование Rb в средней и поздней G1 показывает, что инактивация Rb также является митоген-зависимым шагом. Rb является фактором, супрессирующим клеточный рост, и участвует в контроле G1/S пере- хода, связывая семейство транскрипционных факторов E2F. И. М. Спивак. «Репликация ДНК: учебное пособие» 90 Рис. 32.Регуляция экспрессии циклина D Отсутствия функционально активного белка Rb достаточно для вхождения в фазу S в условиях, ограничивающих клеточный рост. Накопление E2F приводит к преодолению G1- ареста, вызванного подавлением активности циклин D и Е-Cdks киназной активности. Зави- симость от ростовых факторов заканчивается при полном фосфорилировании Rb, приводя- щем к проходу через точку рестрикции в средней G1 и дальнейшему движению по клеточ- ному циклу. Достаточно ли способности циклинов D фосфорилировать Rb для того, чтобы считаться R-белками? Не полностью. Их способность быть сенсором факторов роста зави- сит не только от их быстрой индукции в ответ на митогенные сигналы, но также от их белковой нестабильности, гарантирующей их быструю деградацию в клетках, лишенных ростовых факторов. То, что циклины D являются короткоживущими белками, гарантирует быстрое сокращение их пула при отсутствии митогенов. Индукции одного циклина D недо- статочно для перехода покоящейся клетки через G1 в S. Комплекс циклин Е/Cdk2 возникает позже по отношению к комплексу циклина D/Cdk4 и завершает фосфорилирование Rb. Этот шифт между комплексами циклин Е\Cdk2 и циклин D\Cdk4 объясняет потерю зависимости от факторов роста. Точнее, точка рестрикции рас- положена между пиками активности циклина Е и циклина D. Переход из G1 в S сопровож- дается множественными петлями обратной связи, приводящими к ситуациям, при которых нижележащие события связаны с регуляцией самих себя на более высоком уровне. Напри- мер, и Rb/р130 и р27 оба являются негативными регуляторами циклина Е. Экспрессия с-myc зависит от р21, CDKs и E2F, при том, что c-myc сам является регулятором р21 и CDKs. Таким же образом циклин Е расположен ниже по отношению к Rb и E2F-1, так как он трансактивируется E2F-1. В тоже время завершение фосфорилирования Rb циклином Е и приводит к высвобождению E2F. Позитивная регуляция представляется необратимой. Тот И. М. Спивак. «Репликация ДНК: учебное пособие» 91 же циклин Е, единожды экспрессировавшись становиться в дальнейшем независимым от митоген-зависимого циклина D. Таким образом, циклин Е является более удачным канди- датом на роль R-белка, чем циклин D. Зависимость от ростовых факторов заканчивается в момент полного фосфорилирования Rb, после чего клеткам остается только пройти через точку рестрикции и двигаться по циклу дальше. Таким образом и циклин D и циклин Е, а также и циклин А связанные CDKs фосфорилируют Rb. R-белок разделяется, как минимум, надвое. Кроме того, E2F-1 частично тоже обладает свойствами R-белка. Именно он необходим для начала фазы S. История поиска R-белка показывает, как, расширяясь, наши знания при- водят к выводу о существовании не точки, а узла (knot) рестрикции. Современные представ- ления о точке рестрикции показаны на рис. 33. Рис. 33. Предсталение о природе точки рестрикции. жүктеу/скачать 2,57 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|