ЗАКЛЮЧЕНИЕ
таким
образом,
трансплантат
в
составе
релизата
тромбоцитов,
предифференцированных в остеогенном
направлении
МсК,
остеопластического
материала, фибринового геля эффективен
для замещения костного дефекта в
экспериментальной модели животных.
ЛИТЕРАТУРА
1. Вольперт У.В., Янушевич О.О., Григо-
рьян А.С. и др. Заживление костных дефек-
тов ветви нижней челюсти кроликов под
биоинженерными конструкциями из титана
и золотого сплава с ксеногенными мезенхи-
мальными стволовыми клетками // Стома-
тология. - № 2009. - С. 4-8.
2. Тер-Асатуров Г.П., Лекишвили М.В.,
Бигвава А.Т. и др. Сравнительное исследова-
ние репаративной регенерации костнй тка-
ни при использовании ткнеинженерной ма-
трицы на основе материала «ТИОПРОСТ»
и материала «КоллапАн» // Клеточнаятран-
сплантолгия и тканевая инженерия. – 2011.
- №VI(4). – Р. 89–96.
3. Панин
А.М.
Биокомпозиционные
остеопластические материалы. Примене-
ние и перспективы развития // Стомато-
логия XXI века: сб. статей. - Н. Новгород,
2003.- С. 146–148.
4. Деев Р.В., Цупкина Н.В., Бозо И.Я. и
др. Тканеинженерный эквивалент кости:
методологические основы создания и биоло-
гические свойства // Клеточная трансплан-
тология и тканевая инженерия. – 2011. - №
VI(1).- Р.62–67.
5. Чиссов В.И., Сергеева Н.С, Решетов
И.В. и др. Клеточные технологии в заме-
щении тканевых дефектов в онкологии //
Вестник РАМН. – 2006. - № 6. – С. 34-38.
6. Nurnberg S. Properties and potential
alternative applications of fibrin glue. Biological
adhesive systems // Springer. – Wien, New York,
2010.
7. Eoin D. O’Cearbhaill Behavior of human
mesenchymal stem cells in fibrin-based vascular
ТРАВМАТОЛОГИЯ ЖӘНЕ ОРТОПЕДИЯ 3-4 (33-34)/2015
43
tissue engineering constructs // Annals of
Biomedical Engineering. - 2010. -Vol. 38, № 3.
– Р. 649–657.
8. Rastegar F., Shenaq D., Huang J.
et al. Mesenchymal stemcells: Molecular
characteristics and clinical applications // World
J.Stem Cells. – 2010. -№ 2(4). – Р. 67–80.
9. Cancedda R., Mastrogiacomo M.,
Bianchi G. et al. Bone marrow stromal
10. cells and their use in regenerating bone //
Novartis Found Symp. – 2003. - №249. – Р.133-
143.
ЭКСПЕРИМЕНТТЕ СҮЙЕК ТІНІНІҢ РЕПАРАЦИЯЛыҚ ПРОЦЕССТЕРІН
бЕЛСЕНДІРу МАҚСАТыНДА КСЕНОГЕНДІК МЕЗИНхИМАЛыҚ ДІҢ
ЖАСушАЛАРыН ПАЙДАЛАНу
в.с. ДеРКаЧев, с.а. аЛеКсеев, с.М.
КосМаЧева, Н.Н.
ДаНИЛКовИЧ
Түсініктеме. Зерттеу мақсаты - жануарларға экперимент жүргізуде ксеногендік дің
жасушаларын пайдалануымен сүйек тінінің регенерациясын зерттеу. Экспериментте Шиншилл
тұқымды 25 үйқоянға 1,2,3, ай мерзімде репарациялық регенерациясының динамикасы
зерттелінді. Қоянның кәріжілік сүйек ақауына өзіне адамның мезинхималық дің жасушалары,
тромбоцит лизаттары, «Фибриностат» фибринді желімі енгізілген биотрансплантатымен
толтырылды. салыстыру үшін Коллапан және Кафам остеопластикалық материалдар
алынды. Құрамында биотрансплантаты бар Коллапан материалын қолданған кезде ең
жақсы нәтиже (сүйектің тығыздығы, гистологиясы) алынды.
Негізгі сөздер: стромальді жасуша, тін инженериясы, сүйек тіні.
use of mesencHymal stem cells for reparative processes
activation in bone tissue in experimental conditions
V.S. DeRKacHeV, S.a. aLeKSeeV, S.M. KoSMacHeVa, N.N. DaNILKoVIcH
abstract. In experiment on 25 chinchilla rabbits dynamics regeneration was studed at the
terms 1, 2 and 3 months. In vitro expanded and osteogenic differentiated human MSc were used
to create biotransplantat. Scaffold, platelet releasate and fibrin glue “Fibrinostat” were added in the
place of bone defect. comparison of several scaffold samples (Kollapan and Kafam) was done.
there was shown stimulating action of the MSc implantation in the bone wound upon reparative
osteogenesis at the terms from 1 to 3 months. the best results (bone density, histology) of healing
were achieved with collapan when compared to that without biotransplant. thus we were able to
demonstrate better healing of bone defect when using McS-based biotransplant.
Key words: multipatent stem cells, tissue ingineering, bone tissue.
УДК 617.58-089:616.71-018.46
К ВОПРОСу О КОМПЛЕКСНОМ ЛЕЧЕНИИ хРОНИЧЕСКОГО
ПОСТТРАВМАТИЧЕСКОГО ОСТЕОМИЕЛИТА
в.с.
ДеРКаЧев
1
, с.а.
аЛеКсеев
1
, в.Н.
БоРДаКов
2
, И.а.
еЛИН
2
,
Д.в.
ДеРКаЧев
1
1
Белорусский государственный медицинский университет,
2
432 Главный военный клинический медицинский центр Мо РБ, Минск
проблема
лечения
хронического
посттравматического
остеомиелита
остается актуальной в хирургии и
травматологии, несмотря на достижения
современной медицины. Это объясняется
и
распростраенностью
заболевания,
сложностью диагностики и лечения, высоким
процентом выхода на инвалидность. по данным
ряда авторов, хронический остеомиелит
составляет 7-12% в структуре заболеваний,
ЭкспериМеНтте сҮйек тІНІНІҢ репарациЯлЫҚ процесстерІН
БелсеНДІру МаҚсатЫНДа ксеНоГеНДІк МеЗиНХиМалЫҚ ДІҢ
ЖасушаларЫН пайДалаНу
В.С. ДЕРКАчЕВ, С.А. АлЕКСЕЕВ, С.М.
КОСМАчЕВА, Н.Н.
ДАНИлКОВИч
түсініктеме.
Зерттеу мақсаты - жануарларға экперимент жүргізуде ксеногендік дің жа-
сушаларын пайдалануымен сүйек тінінің регенерациясын зерделеу. Экспериментте шин-
шилл тұқымды 25 үйқоянға 1,2,3, ай мерзімде репарациялық регенерациясының динамикасы
зерделенді. Қоянның кәріжілік сүйек ақауы, өзіне адамның мезинхималық дің жасушалары,
тромбоцит лизаттары, «Фибриностат» фибринді желімі енгізілген биотрансплантатымен тол-
тырылды. Салыстыру үшін КоллапАн және Кафам остеопластикалық материалдар алынды.
Құрамында биотрансплантаты бар Коллапан материалын қолданған кезде ең жақсы нәтиже
(сүйектің тығыздығы, гистологиясы) алынды.
Негізгі сөздер: стромальді жасуша, тін инженериясы, сүйек тіні.
ТРАВМАТОЛОГИЯ ЖӘНЕ ОРТОПЕДИЯ 3-4 (33-34)/2015
44
относящихся к гнойно- хирургической
инфекции, и до 6% среди патологии опорно-
двигательного аппарата, а инвалидизация
достигает 50-90%. традиционная схема
лечения хронического остеомиелита основана
на активной хирургической санации очагов
в кости и адекватной антибактериальной
терапии. важным моментом в терапии
гнойно-септических поражений является
путь введения медикаментозных препаратов.
во время инфузии лекарств в мелкую вену
всегда бывает угроза ее тромбирования,
а при введении препаратов в подключич-
ную вену создается высокое разведение в
кровяном русле препарата, который прихо-
дится вводить в максимальных дозах. при
гнойных заболеваниях конечностей возможно
и успешно применяется внутриартериальное
их введение.
под нашим наблюдением находились 19
пациентов с последствием травм бедра в 7 и
голени в 12 случаях. женщин было 2, мужчин
– 17. средний возраст пациентов был 40,5 лет.
все пациенты имели на момент поступления
функционирующие свищи со скудным
гнойным отделяемым. У 6 отмечалось
наличие выраженных рубцовых изменений
мягких тканей, как следствие длительно
существующих свищей и перенесенных
ранее оперативных вмешательств. при
обследовании пациентов использовались
обычные клинические и рентгеновские методы
исследования, а также микробиологическое
исследование отделяемого из ран и свищей.
Исследование микрофлоры в 92% показало
рост Staphylococcusaureus в ассоциации c es-
herichia coli, в 8% - Pseudomonas aeruginosa.
в предоперационном периоде всем пациен-
там обязательно выполняли рентгенографию,
фистулографию и РКт.
в день операции при поражении нижних
конечностей производилась катетеризация
бедренной артерии по сельдингеру. в состав
инфузата входили препараты, улучшающие
реологию крови (реополиглюкин и трентал),
сосудорасширяющие средства (новокаин,
папаверин), витамины, антигистаминные
препараты и антибиотики. До получения
микробиологического анализа использовались
антибиотики широкого спектра действия, в
дальнейшем антибактериальная терапия
проводилась с учетом чувствительности
микрофлоры к ним. Идеальный вариант
лечения - комплексный подход с участием
специалистов по травматологии, гнойной
хирургии, пластических хирургов и, при
необходимости, других врачей-консультантов.
Хирургическое лечение остеомиелита
осуществлялось на основе общепринятых
принципов:
радикальная
хирургическая
обработка;
проведение
стабильного
остеосинтеза; замещение костных полостей;
обеспечение
полноценного
замещения
мягкотканных дефектов.
первичное вмешательство заканчивали
тампонадой костной полости салфетками
с
водорастворимой
мазью.
после
оценки состояния раны на 5-7 сутки
послеоперационного периода заполняли
костную полость препаратом «Коллапан»
(РФ). в трех случаях применили костный
аутотрансплантат
с
сохранением
кровоснабжения. в одном случае для
стимуляции
остеогенеза
использовали
аутологичные МсК. объем замещаемого
дефекта костной ткани в среднем составил
54 ±7,2см
3
. Кожная рана ушивалась наглухо с
оставлением резиновых дренажей на 2-3 су-
ток. в двух случаях требовалось пластическое
перемещение тканей. в частности использо-
вался суральный лоскут. Иммобилизация в
послеоперационном периоде осуществлялась
применением спице - стержневого аппарата
различной компановки. Катетер из бедренной
артерии удаляли через 23±2 суток, осложне-
ний катетеризации не было ни в одном слу-
чае.
Использование
внутриартериальной
инфузионной терапии в сочетании с
оперативным вмешательством достаточно
эффективно при комплексном лечении
тяжелых
гнойно-воспалительных
заболеваний конечностей. она позволяет
купировать воспалительный процесс и
добиться выздоровления в большинстве
случаев.
ТРАВМАТОЛОГИЯ ЖӘНЕ ОРТОПЕДИЯ 3-4 (33-34)/2015
45
УДК 616.71-091-089.843-018]:57.085
СОЗДАНИЕ in vitro КЛЕТОЧНОГО ТРАНСПЛАНТАТА ДЛЯ ЗАМЕЩЕНИЯ
КОСТНОГО ДЕфЕКТА у ЖИВОТНых
в.с. ДеРКаЧев
1
, с.а.
аЛеКсеев
1
, с.М. КосМаЧева
2
,
Н.Н. ДаНИЛКовИЧ
2
1
Белорусский государственный медицинский университет,
2
Республиканский научно-практический центр трансфузиологии и медицинских
биотехнологий, Минск
предложена технология создания трансплантата с использованием мультипотентных
мезенхимных стромальных клеток (ММсК) для лечения дефектов костей у
экспериментальных животных (кролики). трансплантат в своем состве имеет материал–но-
ситель, ММсК, лизаты тромбоцитов и фибриновый клей «Фибриностат». область приложе-
ния: traumatology, хирургия, клеточная биотехнология.
Ключевые слова: стромальные клетки, тканевая инженерия, костная ткань.
ВВЕДЕНИЕ
актуальной
задачей
травматологии
и
хирургии
является
восстановление
утраченного объема костной ткани с помощью
биологических пластических материалов.
аутогенные костные трансплантаты являются
«золотым стандартом» при проведении
реконструктивных операций на костях.
однако,
дополнительное
оперативное
вмешательство, а также, трудности при
получении
значительного
количества
аутоматериала, в определенной мере
ограничивают их применение.
альтернативой к имеющимся технологиям,
применяемым для реконструкции костных
дефектов, является тканевая инженерия
[1]. основная задача тканевой инженерии
в области лечения костных патологий
– создание искусственных композитов,
состоящих из алло- и/или ксеноматериалов
в сочетании со стволовыми клетками
и биоактивными молекулами (костные
морфогенетические белки, факторы роста
и т.д.), способных индуцировать остеогенез.
в последнее время для пластики костных
дефектов все шире применяются различные
синтетические костные имплантаты в виде
материалов из керамики, коллагеновых
и неколлагеновых белков, биоактивных
стекол и биодеградиуемых полимеров [2].
анализ литературы позволяет сделать
вывод о том, что, несмотря на наличие
большого количества материалов для
костной пластики, на сегодняшний день ни
один из них не отвечает всем требованиям
современной реконструктивной хирургии.
cинтетические материалы, используемые
для заполнения костных дефектов в
процессе
оперативных
вмешательств,
имеют ряд недостатков. полимерные
синтетические и металлические материалы,
разрешенные к применению, обладают
недостаточной
биосовместимостью,
а
покрытия, увеличивающие их совместимость
обычно не долговечны. Эти обстоятельства
обуславливают необходимость разработки
биосовместимых материалов для заполнения
костных дефектов и стимуляции остеогенеза
в дефекте. в идеале такие материалы
должны быть биосовместимыми, т.е. не
отторгаться и не угнетать морфогенетических
потенций окружающих тканей, поддерживать
дифференцировку собственных стромальных
стволовых
клеток
надкостницы,
или
ауто- и аллогенных культур клеток, иметь
открытую пористость и взаимосвязанность
пор
для
обеспечения
биологических
потоков и заселения клетками. скорость
резорбции таких материалов должна быть
сопоставима со скоростью формирования в
месте дефекта новой костной ткани [2,3,4].
если же обратиться к идеологии тканевой
инженерии в отношении костной патологии,
то предполагается сочетание остеогенных
клеток
и
материала–носителя
[5].
предъявляемым требованиям соответствуют
материалы на основе гидроксиапатита (Га).
они исследованы на биосовместимость
при подкожной имплантации животным и
Предложена технология создания трансплантата с использованием мультипотентных
мезенхимных стромальных клеток (ММСК) для лечения дефектов костей у эксперименталь-
ных животных (кролики). Трансплантат в своем составе имеет материал–носитель, ММСК,
лизаты тромбоцитов и фибриновый клей «Фибриностат». Область приложения: traumatol-
ogy, хирургия, клеточная биотехнология.
ключевые слова: стромальные клетки, тканевая инженерия, костная ткань.
1
Белорусский государственный медицинский университет,
2
Республиканский научно-практический центр трансфузиологии и медицинских
биотехнологий, Минск
ТРАВМАТОЛОГИЯ ЖӘНЕ ОРТОПЕДИЯ 3-4 (33-34)/2015
46
эффективность при замещении костных
дефектов у животных. Испытания in vivo
материалов на основе Га показали, что эти
материалы не вызывали реакции отторжения,
активно участвовали в образовании новой
костной ткани при замещении дефектов.
только
искусственный
материал
не
способен участвовать в восстановлении
кости, поэтому в последнее время
предполагают использовать искусственные
материалы в совокупности с аутологичными
мезенхимальными стволовыми клетками
(МсК) [6]. Интерес к стромальным клеткам
костного мозга (КМ) обусловлен тем, что
эти клетки довольно легко можно выделить
из аспиратов КМ пациента, а после
многократного наращивания их количества и
манипуляций in vitro трансплантировать ему
же без риска отторжения.
в настоящее время в клинической
практике с целью стимуляции процесса
остеогенеза находит метод использования
обогащенной тромбоцитами аутоплазмы. в
тромбоцитах содержатся многочисленные
факторы роста и цитокины, способствующие
свертыванию крови, регенерации ткани и
процессам минерализации кости [7,8,9].
Цель
исследования:
разработать
технологию создания многокомпонентного
биотрансплантата и оценить возможность
использования
МсК
костного
мозга
для замещения дефектов костей у
экспериментальных животных.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДы
МсК получали из костного мозга человека
путем пункции крыла подвздошной кости и
культивировали in vitro.
РЕЗуЛЬТАТы И Их ОбСуЖДЕНИЕ
1. Наращивание и пре-дифференцировка
МсК для трансплантанта. МсК костного
мозга наращивали в течение 3-х пассажей
в культуральной среде α-MeM (Sigma) с
добавлением 10% эмбриональной телячьей
сыворотке (Sigma), 100 ед/мл пенициллина,
100 мкг/мл стрептомицина. в течение
культивирования оценивали морфологию
и контролировали стерильность. при
достижении клетками 3-го пассажа 80-
90% конфлюентности меняли питательную
среду
на
остеогенную
индукционную
среду (полная питательная среда с
дифференцировочными
факторами:
дексаметазон (0,1 мМ), аскорбиновая кислота
(50 мкМ) и β-глицерофосфат (10 мМ)).
предифференцировку проводили в течение
5-7 дней с заменой среды через 3 дня.
получение клеточного трансплантанта
для экспериментов in vivo. после завершения
культивирования пре-дифференцированные
клетки снимали с адгезионной поверхности
флаконов т75 0,25% раствором трипсина
с ЭДта, отмывали 0,9% раствором натрия
хлорида изотоническим для инфузий (Nacl,
пр-во РУп «Несвижский завод медицинских
препаратов») с 1 % сыворотки ав (IV)
человека центрифугированием 10 мин. при
1500 об/мин. Индуцированные к остеогенной
дифференцировке МсК ресуспензировали в
1,5 мл 0,9% раствора Nacl c добавлением 5%
сыворотки ав (IV).
проводили
подсчет
количества,
определение жизнеспособности клеток и
иммунофенотипический контроль культуры
клеток. суспензию клеток из пробирки Falcon
15 мл переносили в криопробирку на 5 мл и
помещали в термоконтейнер для дальнейшей
транспортировки.
приготовление
комбинаций
биотрансплантатов
на
основе
МсК
для замещения дефектов костей у
экспериментальных
животных.
Данные
литературы свидетельствуют, что стволовые
клетки, введенные в костные дефекты,
стимулируют репаративный остеогенез и
способствуют более быстрому заживлению
костных ран. особый интерес представляет
совместное использование для лечебных
целей стволовых клеток и трансплантационных
материалов [6]. Для получения 3D
конструкции-носителя МсК, при замещении
костных дефектов в экспериментальной
модели на кроликах использовали препарат
фибринового геля «Фибриностат» (пр-во
РНпЦ трансфузиологии и медицинских
биотехнологий, РБ). Фибриновый гель
является
естественным
природным
биоматериалом и более перспективным как
в качестве временной матрицы для роста,
размножения и дифференцировки клеток, так
и для повышения гемостаза. Этот материал
успешно используется как в костной, так
и в пластической хирургии. в ортопедии,
фибриновый гель используется в различных
процедурах, в том числе и для фиксации
костно-хрящевых фрагментов [10,11].
в качестве примера представляем
один из вариантов многокомпонентного
трансплантата.
ТРАВМАТОЛОГИЯ ЖӘНЕ ОРТОПЕДИЯ 3-4 (33-34)/2015
47
МсК 1-го пассажа 1,8х106 высевали
на 5 флаконов т-75 по 0,36х106 клеток на
флакон в посевной концентрации 4,8х103/
см2 . Культивировали клетки при 37º с и
5% со2. при наращивании клетки имели
фибробластоподобную
морфологию;
имели длинные, нередко разветвляющиеся
отростки
и
обычно
располагались
небольшими группами, контактируя между
собой. Через 7 дней, когда конфлюентность
монослоя достигла 85-90%, МсК 2-го
пассажа перевели на остеоиндукционную
среду. предифференцировка проводилась
7 дней. по истечении 7-ми дней клетки
имели фибробластоподобную морфологию.
Количество пре-остеоиндуцированных МсК
после снятия с культивируемой поверхности
составило 9,2х106. Клетки ресуспендировали
в 1,5 мл. 0,9% физ. раствора с 5% сывороткой
ав.
продолжительность
наращивания
клеточного трансплантата составила 7 дней,
наращивание с учетом остеоиндукции – 14
дней.
ВыВОДы
получены положительные результаты
по взаимодействию in vitro основных
компонентов биотрансплантанта.
определены основные составляющие
многокомпонентного
остеогенного
биотрансплантанта.
подготовлены
трансплантаты
для замещения костных дефектов в
экспериментальной модели in vivo у
животных.
ЛИТЕРАТУРА
1. Деев Р.В. Постравматическая реге-
нерация костной ткани при транспланта-
ции костномозговых стромальных клеток:
дисс….канд.мед.наук. - Санкт-Питербург:
Военно-медицинская академия, 2006.
2. Чиссов В.И., Сергеева Н.С., Реше-
тов И.В. и др. Клеточные технологии в за-
мещении тканевых дефектов в онкологии //
Вестник РАМН. - 2006. - № 6. – С.34-38.
3. Чиссов В.И., Свиридова И.К., Сергее-
ва Н.С. и др. Изучение in vivo биосовместимо-
сти и динамики замещения дефекта голени
у крыс пористыми гранулированными био-
керамическими материалами // Клеточные
технологии в биологии и медицине. – 2008.
- №3. – С. 151-156.
4. Сергеева Н.С., Свиридова И.К., Ре-
шетов И.В. и др. Разработка биоинженер-
ных конструкций на основе аутологичных
мезенхимальных стволовых клеток и 3D
материалов - матриксов синтетических и
природного происхождения с целью восста-
новления костных дефектов у эксперимен-
тальных животных // Материалы III Все-
российского симпозиума с международным
участием «Актуальные вопросы тканевой
и клеточной трансплантологии». – Москва,
2007. - С. 41-42.
5. Пат. 2000119939/14 РФ. Способ вос-
становления целостности костей и транс-
плантат для его осуществления / Чайлахян
Р.К.; заявитель и патентообладатель Ин-
ститут эпидемиологии и микробиологии им
Н.Ф.Гамалеи. - №2167662; заявл.27.07.2000;
опубл. 27.05.2001, Бюл. № 7.
6. Вольперт У.В., Янушевич О.О., Григо-
рьян А.С. и др. Заживление костных дефек-
тов ветви нижней челюсти кроликов под
биоинженерными конструкциями из титана
и золотого сплава с ксеногенными мезенхи-
мальными стволовыми клетками // Стома-
тология. – 2009. - №2. - С. 4-8.
7. Bertoldi C., Pinti M., Zaffe D. et al.
Morphological, histochemical, and functional
analysis of platelet-rich plasma activity on
skeletal cultures cells // Transfusion. - 2009.-Vol.
49 (8). - P. 1728 – 1737.
8. Корж Н.А., Кладченко Л.А., Малыш-
кина С.В. Имплантационные материалы и
остеогенез. Роль оптимизации и стимуля-
ции в реконсирукции кости // Ортопедия,
травматология, протезирование. – 2008.
- №4. – С.5-14.
9. Кузьминых И.А. Хирургическое лече-
ние радикулярных кист с использованием
биокомпозиционного м атериала «аллома-
трикс-имплант» и фибрина, обогащенного
тромбоцитами: автореф.…канд. мед. наук.
– Пермь, 2008. – 22 с.
10. Nurnberg S. Properties and potential
alternative applications of fibrin glue. Biological
adhesive systems // Springer Wien New York. –
2010.
11. Eoin D. O’Cearbhaill Behavior of human
mesenchymal stem cells in fibrin-based vascular
tissue engineering constructs // Annals of
Biomedical Engineering. – 2010. - Vol. 38, № 3.
– Р. 649–657.
ТРАВМАТОЛОГИЯ ЖӘНЕ ОРТОПЕДИЯ 3-4 (33-34)/2015
48
Достарыңызбен бөлісу: |