Принципы подбора исходного объекта для селекции продуцентов Подготовка исходного штамма к селекции
жүктеу/скачать 34,28 Kb.
|
- Бұл бет үшін навигация:
- Требования, предъявляемые к промышленным штаммам 5 Селекция продуцентов аминокислот 5 Селекция продуцентов ферментов
СодержаниеВведение 1 Принципы подбора исходного объекта для селекции продуцентов 3 Подготовка исходного штамма к селекции 4 Требования, предъявляемые к промышленным штаммам 5 Селекция продуцентов аминокислот 5 Селекция продуцентов ферментов 6 Селекция продуцентов вторичных метаболитов 7 Введение. Основными промышленными объектами селекции продуцентов являются микроорганизмы – бактерии, дрожжи и микроскопические мицелиальные грибы. Человек с давних времен использовать деятельность микроорганизмов для выпечки хлеба и пивоварения, получения вина и уксуса, приготовления молочнокислых продуктов. Микроорганизмы обладают высокой скоростью роста, способны расти на дешевых питательных средах, и обладают пластичным метаболизмом, протекающим с высокой скоростью и эффективностью. Так, например, КПД превращения углерода субстрата в углерод клеточной биомассы в клетках Escherichia coli составляет 70 %. Все это дает предпосылки для использования клеток микроорганизмов для производства различных биологически активных веществ. Однако, метаболизм клетки подвержен строгой и четкой регуляции. Микроорганизмы синтезируют такое количество первичных метаболитов, которое необходимо для роста и деления клетки. Для использования штамма микроорганизма в качестве промышленного продуцента эта регуляция должна быть изменена таким образом, чтобы использовать биосинтетический аппарат клетки для получения максимального количества необходимого метаболита, т.е. создания непрерывного синтеза. Решение этой задачи существенно облегчается, если известен путь биосинтеза интересующего нас метаболита и его регуляция, что дает возможность разработать подходы для дерегуляции определенных этапов этого синтеза путем насыщения генома продуцента необходимыми мутациями. Долгое время получение промышленных штаммов микроорганизмов основывалось на внесении в геном клетки индуцированных мутаций и отбора лучших вариантов. Этот метод очень трудоемок и может занимать длительное время. Однако, его использование может приводить к значительному увеличению уровня продукции метаболита. Так, с помощью ступенчатого отбора штаммов-продуцентов пенициллина уровень активности штамма микроорганизма был увеличен с 100 ед/мл до 40000 ед/мл. С 70-х годов прошлого века начинается целенаправленное конструирование штаммов продуцентов различных биологически активных веществ с использованием методов генетической инженерии. Первые штаммы-продуценты конструировались на основе клеток Escherichia coli. Уже в 1977-1979 гг. на основе этих бактерий были созданы штаммы-продуценты соматостатина, инсулина и гормона роста человека. В настоящее время круг микроорганизмов, на основе которых конструируют генно-инженерные штаммы-продуценты, существенно расширен. Основное преимущество микроорганизмов как объекта селекции продуцентов – более простая по сравнению с эукариотами организация генетического аппарата. Поэтому клонирование генов в клетки растений и животных осуществляется на основе первичного их клонирования в микробных клетках. Методы современной селекции продуцентов основываются на генетическом конструировании in vivo и in vitro. Генетическое конструирование in vivo позволяет получить и выделить мутанты, используя различные способы обмена генетической информацией между живыми микробными клетками: гибридизацию, конъюгацию, трансформацию, трансдукцию, транспозонный мутагенез и слияние протопластов. Генетическое конструирование in vitro основано на введении индивидуальных фрагментов ДНК в живую клетку с получением рекомбинантных генетических структур с заданными свойствам Стратегия селекционной работы с микроорганизмами заключается в поиске природных форм, которые обладают какими-либо полезными для человека свойствами (синтез ценных соединений, высокая скорость роста, способность к усвоению дешевых и доступных субстратов и т.д.), а также дальнейшем их улучшении, создании на их основе промышленных штаммов. Эта задача решается обычно путем изменения регуляции метаболической активности клетки. Все клеточные метаболиты можно разделить на три группы: молекулы с большой, до нескольких миллионов, молекулярной массой (ферменты и полисахариды) первичные метаболиты, соединения необходимые для роста клетки (аминокислоты, нуклеотиды. витамины и др.) вторичные метаболиты, соединения, которые не требуются микроорганизмам для роста (антибиотики, алкалоиды и др.). Для того, чтобы осуществлять промышленный синтез биологически активных веществ штаммы-продуценты должны продуцировать в среду количество метаболита достаточное для его рентабельного производства. Однако, как было отмечено выше, природные штаммы микроорганизмов, как правило, не способны выделять и накапливать в питательной среде такое количество продукта, которое могло бы обеспечить достаточно низкую себестоимость при производстве. Так, некоторые природные штаммы грибов, актиномицетов и бацилл способны продуцировать небольшие количества антибиотиков, токсинов, гидролитических ферментов. Однако в отношении первичных метаболитов этого не наблюдается, поскольку эти биосинтетические пути настолько жестко зарегулированы в клетке, что синтезируемое количество данных метаболитов строго соответствует потребностям самой клетки. Поэтому перед селекционерами стоит задача правильно подобрать исходный микроорганизм для селекции. Микроорганизмы, которые являются природными продуцентами даже небольшого количества того или иного метаболита являются исходными штаммами для селекции продуцента этого вещества. Дальнейшая работа направлена на повышение уровня продукции метаболита путем получения мутаций, усиливающих продукционную способность отобранного микроорганизма. В том случае, если создается продуцент первичного метаболита и клетки микроорганизмов не способны накапливать продукт в питательной среде, продуцент создается из штаммов дикого типа. Здесь в первую очередь нужно учитывать ограничения для сверхсинтеза определенного вещества. Например, у представителей глутаматпродуцирующих бактерий Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum получены высокие уровни продукции лизина, а у бактерий рода Pseudomonas или E. coli этот уровень значительно ниже. Это обстоятельство объясняется различной регуляцией пути синтеза аминокислоты у этих микроорганизмов. Так, у C. glutamicum, и Br. flavum синтез лизина контролируется только на уровне ретроингибирования одного фермента лизином и треонином. Причем этот контроль легко устраняется мутацией, блокирующей синтез гомосерина – предшественника треонина и метионина. При этом поток общих предшественников направляется на синтез лизина. У бактерий рода Pseudomonas и E. coli этот биосинтетический путь жестко зарегулирован: имеется 3 контролируемых на уровне терминации транскрипции структурных гена, а у 10 псевдомонад еще и сложная система аллостерической регуляции. Кроме того, у коринебактерий отсутствует система деградации лизина, тогда как у псевдомонад эта система выражена очень ярко. Таким образом, выбор штаммов-продуцентов вторичных метаболитов основан на поиске природных штаммов, способных выделять в среду некоторое количество продукта. Выбор же продуцентов первичных метаболитов основан на подборе штаммов имеющих менее сложные по сравнению с другими микроорганизмами системы регуляции метаболита с последующим введением в геном потенциального продуцента мутаций, которые теоретически могут вызвать сверх синтез продукта. Таким образом, выбор исходного штамма зависит от: природных свойств штамма, ограничений, связанных со сложностями систем регуляции синтеза как на генетическом, так и на аллостерическом уровне. жүктеу/скачать 34,28 Kb. Достарыңызбен бөлісу:
|