Метод полимеразной цепной реакции

141 
метода заключается в многократном копировании (амплификации) 
определенных, специфических только для данной мишени участков ДНК в 
процессе повторяющихся температурных циклов. На каждом цикле 
амплификации синтезированные ранее фрагменты вновь копируются ДНК-
полимеразой. Благодаря этому происходит увеличение концентрации 
специфических для данной мишени фрагментов ДНК в миллионы раз, что 
значительно упрощает дальнейший анализ. 
Для проведения полимеразной цепной реакции необходимо наличие в 
реакционной смеси ряда основных компонентов. 
Праймеры – искусственно синтезированные олигонуклеотиды, 
имеющие, как правило, размер от 15 до 30 нуклеотидов, идентичные 
соответствующим участкам ДНК-мишени. Они играют ключевую роль в 
образовании продуктов реакции амплификации. Правильно подобранные 
праймеры обеспечивают специфичность и чувствительность тест-системы. 
Taq-полимераза – термостабильный фермент (максимальная активность 
фермента проявляется при темп. 70-74ºС (хотя фермент может работать и при 
более низких температурах). Источник происхождения этого фермента – 
микроорганизм Thermus aquaticus, время полужизни при 94

С составляет 
около 45 мин. Taq-полимераза обеспечивает достраивание 3’-конца второй 
цепи 
ДНК 
согласно 
принципу 
комплементарности. 
Смесь 
дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) дезоксиаденозинтрифосфата (дАТФ), 
дезоксигуанозинтрифосфата (дГТФ), дезоксицитозинтрифосфата (дЦТФ) и 
дезокситимидинтрифосфата 
(дТТФ) 
– 
«строительный 
материал», 
используемый Taq-полимеразой для синтеза второй цепи ДНК. 
Буфер – смесь катионов и анионов в определенной концентрации, 
обеспечивающая оптимальные условия для реакции, а также стабильное 
значение рН. 
Анализируемый образец – это подготовленный к внесению в 
реакционную смесь препарат, который может содержать искомую ДНК, 
например ДНК микроорганизмов, служащую мишенью для последующего 

142 
многократного копирования. При отсутствии ДНК-мишени специфический 
продукт амплификации не образуется. 
В идеальных условиях проведения реакции за 35 циклов ПЦР 
синтезируется несколько миллиардов копий ампликона определенной длины. 
Этого количества достаточно для достоверной визуальной детекции этого 
фрагмента, например, с помощью флюориметрии или методом 
электрофореза в агарозном геле. 

жүктеу/скачать 4,09 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: