4 неделя(тератогенные и мутагенные факторы, их влияние на репродуктивную систему мужчин и женщин)
жүктеу/скачать 107,06 Kb.
|
| Молекулярно-генетические методы - это большая и разнообразная группа методов, позволяющих выявить различные вариации в структуре ДНК, вплоть до расшифровки первичной последовательности нуклеотидов. Основные этапы и варианты молекулярно-генетических методов:
Получение образцов ДНК (или РНК) является исходным этапом всех методов. Источником ДНК могут быть любые ядросодержащие клетки: лейкоциты периферической крови, хорион, амниотические клетки, культуры фибробластов, соскоб слизистой щеки, несколько волосяных луковиц и т.д. При этом требуется очень малое количество материала. Полученная ДНК пригодна для всех методов и может долго сохраняться в замороженном виде. Чаще, для успешной диагностики болезни или гетерозиготного носительства достаточно иметь лишь небольшой фрагмент ДНК. Размножить (амплифицировать) в большом количестве нужный фрагмент можно с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). ПЦР - это метод амплификации ДНК в условиях in vitro. Для этого необходимо узнать нуклеотидную последовательность данного фрагмента, и синтезировать два олигонуклеотидных праймера (затравки). Процесс амплификации включает 3 стадии: температурная денатурация ДНК присоединение(разделение двухцепочечной ДНК на одноцепочечные молекулы) праймеров к комплементарным последовательностям одноцепочечных молекул (отжиг) синтез полинуклеотидных цепей на одноцепочечных молекулах в границах присоединенных праймеров с помощью полимеразы. Многократное повторение данного цикла позволяет размножить определенную последовательность ДНК в миллион и более раз. Рестрикция (разрезание) ДНК на фрагменты является необходимым этапом в молекулярной диагностике. Этот процесс осуществляется рестриктазами, относящимися к группе бактериальных эндонуклеаз. В генетике человека используется несколько десятков разных видов рестриктаз, которые разрезают двухцепочечную ДНК в строго определенных участках нуклеотидной последовательности, протяженностью в 4-6 пар оснований. Разные рестриктазы узнают разные последовательности, т.е. имеют разные сайты рестрикции. При этом получается строго определенное количество фрагментов ДНК разной длины, характерное для каждого вида рестриктазы. Метод полиморфизма длин рестриктных фрагментов (ПДРФ) широко используется для выявления степени родства ДНК разных организмов. Электрофорез фрагментов ДНК - обеспечивает распределение фрагментов на поверхности агарозного или полиакриламидного геля в зависимости от их размера. Фрагменты ДНК движутся в геле, помещенном в постоянное электрическое поле от отрицательного полюса к положительному со скоростью, зависящей от размеров фрагмента. Длину каждого фрагмента можно определить путем сравнения пройденного фрагментом расстояния с расстоянием, пройденным стандартным образцом ДНК с известными размерами. Визуализация (обнаружение) фрагментов в геле является либо конечным этапом диагностики, либо необходимым элементом дальнейшего анализа. Гель обрабатывается этидия бромидом, который связывается с ДНК. При УФ-облучении геля на его поверхности выявляется красное свечение. Разработаны и другие варианты окраски фрагментов, позволяющие проводить автоматическую регистрацию результатов. Идентификация фрагментов ДНК - выделение специфических (нужных) фрагментов из геля в настоящее время производится чаще с помощью блот-гибридизации по Саузерну. Нужный фрагмент опознается с помощью специального зонда, который имеет известную последовательность нуклеотидов и комплементарно связывается с данным фрагментом. Эта методика состоит из следующих этапов: гель помещают в раствор щелочи, в которой водородные связи между цепочками разрушаются и получаются одноцепочечные фрагменты ДНК для визуализации нужных фрагментов используют специфический зонд синтетический одноцепочечный олигонуклеотид в 16-30 оснований, меченный радиоактивной или флуоресцентной меткой или антителами. Этот зонд комплементарно связывается с нужным нам фрагментом ДНК. Благодаря разработке молекулярно-генетических методов в настоящее время стало возможным диагностировать практически любую болезнь, связанную с нарушением в структуре генетического материала. Эти технологии нашли широкое применение в связи с исследованиями генома человека. Большинство методик автоматизированы, и в будущем, могут стать рутинными методами расшифровки генома каждого человека. жүктеу/скачать 107,06 Kb. Достарыңызбен бөлісу:
|