Кенжебаева Сəуле Сағындыққызы биотехнологиядағЫ Қазіргі əдістер
Белоктардың біріншілік құрылымын анықтау
жүктеу/скачать 5,04 Mb. Pdf көрінісі
|
| 2.10. Белоктардың біріншілік құрылымын анықтау
Белоктардың біріншілік құрылымын анықтау – бұл полипептидті тізбектегі аминқышқылдардың орналасу ретін анықтау. Бұл мəселені секвенирлеу тəсілінің көмегімен шешуге болады. Қазіргі күні секвенирлеу көмегімен тек бірнеше ондаған аминқышқыл қалдықтарын анықтауға ғана мүмкіндік береді. Алынған фрагменттерді секвенирлегеннен кейін бастапқы реттілікпен қайта тігу керек. Белоктардың біріншілік құрылымын анықтаудың негізгі үш кезеңі бар: 1. Секвенирлеуге жарамды ұзындықта белоктардың бөлiктерін ыдырату. 2. Алынған əрбір фрагментті секвенирлеу. 3. Оның анықталған бөлік құрылымдарынан белоктың толық құрылымын жинастыру. Белоктардың арнайы ыдырауы үшін белгіленген нүктелерге ферментативті жəне сонымен қатар химиялық тəсіл де қолданылады. Белгіленген нүктелер бойынша белоктың гидролизін катализдеуде кеңінен қолданылатын фермент – трипсин жəне химотрипсин. Трип- син лизин жəне аргенин қалдықтарынан кейін орналасқан пептидті байланыстың гидролизін катализдейді. Химотрипсин ароматты аминқышқылдар – фенилаланин, тирозин, триптофон қалдықтарынан кейін орналасқан белоктарды ыдыратады. Қажет болса, трипсин ерекшелігі жоғарлатылуы немесе өзгертілуі мүмкін. М: зерттеліп жатқан белокты цитроконды ангидридпен өңдеу лизин қалдықтарының ацилденуіне алып келеді. Бұл өзгертiлгенi белокта ыдырау тек аргенин қалдықтары бойынша өтетін болады. Белоктарды ыдырату үшін химиялық тəсілді қолданғанда, метио- нин қалдықтары бойынша белокты ыдырату үшін бромциан кеңінен қолданылады. 106 Секвенирлеу Эдман тəсілі ретінде танымал. Эдман тəсілі фенили- зотиоцианат қолдануға негізделген жəне сол арқылы фенилтиогидан- дардың түзілуіне əкеледі. Нəтижесінде, фенилтиогидантион түзіледі, оның құрамында бүйірінде R1 аминқышқыл радикалы бар, олар ги- дантионды айыруға мүмкіндік беретін тиісті белоктың аминқыш- қылдарының құрамы əртүрлі болады, соған сəйкес қандай да бір физикалық, физикалық-химиялық өлшеу арқылы сипаттауға мүмкіндік береді. Мұндай сипаттамаға масс-спектрометр көмегімен анықталатын гиадионтты жүйе немесе молекулярлы салмағы үлгілерін стандартты хроматографиямен анықтау есептеледі. N-соңғы аминқышқыл қалдығының тиогидантионға өзгеруі талда- нып жатқан полипептидті тізбектің бір шынжырға қысқаруына алып келеді. Осы пептидті бөлу арқылы зерттеуші барлық процедураны қайталауға, екінші аминқышқыл қалдығының табиғатын анықтауға жəне екі шынжырға қысқартылған полипептидті бөліп алу мүмкіндігіне ие болады. Мұндай сатылы деградацияны бірнеше рет қайталау полипептидтің негізін құрайтын аминқышқыл қалдықтарының құрамын, біріншілік құрылымын анықтауға мүмкіндік береді. Эдман тəсілінің іс жүзіндегі мəні кезектесе орындалатын про- цедуралар: изотиоцианат қосу, тиогидантионды ыдырату, ары қарай сəйкестендіру үшін оны қысқартылған полипептидтен бөлу, ары қарай өңдеу үшін жарамды күйінде қалдық полипептидті бөлуді көп рет қайталауды талап етеді. Зерттеушілерді мұндай көп жұмыстан арылту үшін, барлық аталған операцияларды орындау да автоматты құрылғылар – полипептидтердің автоматты секвенаторы орнатылған. Олардың көмегімен 40-60 сатылы деградацияларды өткізуге болады. Белоктардың біріншілік құрылымын анықтаудың соңғы сатысы бастапқы пептидте орналасқан фрагменттердің секвенирленген ретін қалпына келтіру болып табылады. Бұл мақсатқа көбіне қабаттасатын белоктардың тəсілі қолданылады. Бұл тəсілдің негізгі идеясы: егерде зерттеліп жатқан трипсин көмегімен ыдыратылып алынған белоктың барлық полипептид құрылымы анықталса (ары қарай мұндай полипеп- тидтер Т əрпімен белгіленеді), енді бұл пептидтердің əрбірі қандай екі Т пептидтермен (N жəне C – соңында) көршілес болатындығын анықтау керек. Секвенирленген Т пептидтердің құрылымында мұндай мəлімет толығымен болмайды. Бірақ та оны кей жағдайларда толығымен қалпына келтіруге болады. Мысал ретінде төменде химотртипсин- 107 мен ыдыратылып алынған полипептидтер жайында (С тобының полипептидтері) болады. Егерде екі Т пептид бастапқы тізбекте көршілес болса, онда С пептид болады, өз құрамында толығымен не- месе қарастырылып отырған Т пептидтердің аз мөлшерде оң бөлігінің С соңғы бөлігін жəне сол жақ пептидтің N соңын өз құрамына ала- ды. С пептид екі көршілес Т пептидті жабады, тəсілдің аталуы осыған орай қойылған. Осылайша, С жəне Т пептидтер құрылымын қарастыра отырып, зерттеліп отырған əрбір Т пептид үшін олар көршілес не- месе бір немесе бірнеше Т пептидпен бөлінгендігін анықтауға бо- лады. Біркелкілік болмауы тек жабылатын С пептидтердің соңғы фрагменттері екі немесе бірнеше Т пептидтерде кездескен жағдайда орын алуы мүмкін. Оның болу мүмкіндігі жоғары емес. Егерде ол іске асса, комбинаториканың күрделі тəсілдерін қолданады. жүктеу/скачать 5,04 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|