С курсом факультета повышения квалификации и переподготовки кадров
жүктеу/скачать 2,61 Mb. Pdf көрінісі
|
- Бұл бет үшін навигация:
- Ионообменная хроматография
- Аффинная хроматография
- Гель-фильтрация
Глава 19. ТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ И СТАНДАРТИЗАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ 237 растворители. Растворители удаляют диализом или ультрафильтрацией через гель. Для хроматографического фракционирования используют ионообменную, аффинную хроматографию и гель-фильтрацю. При этом к сорбентам, образующим гели, относят кальция фосфат, алюминия гидроксид, цинка гидроксид, древесный уголь. Значение рН слабокислое (5,0–6,0). Ионообменная хроматография. Сорбенты – сополимеры метакриловой кислоты и различных гидрофобных мономеров, натуральные и синтетические полисахаридные иониты (гранулированные ионообменные целлюлозы, которые являются не только анионитами, но и катионитами). Для удаления неактивных белков, пигментов и т.п. колонку промывают щелочами, водой, кислотами и затем снова водой, иногда для удаления липофильных веществ промывку проводят органическими растворителями или детергентами. Конечный этап – промывка буферным раствором. Таким образом, сорбент регенерируют. Аффинная хроматография – метод, где сорбентом служит полимерный гель, с которым фермент или группа ферментов взаимодействуют избирательно с образованием стабильной связи. В результате чего из многокомпонентной смеси белков лишь один фермент (группа ферментов) задерживается на колонке (переходит из раствора в нерастворимый сорбент), а все сопутствующие вещества выходят с током растворителя. Чем больше белков связывает сорбент, тем меньше его селективность (идеальный вариант – связывание одного фермента). Центром связывания служат лиганды, присоединенные к матрицам (субстраты, их аналоги, обратимые ингибиторы, коферменты, антитела и др.). Лиганд специфически взаимодействует с активным центром фермента. В качестве матрицы используют полимеры с крупнопористой (для проникновения молекул фермента внутрь) гидрофильной (для обеспечения отсутствия взаимодействия белков со специфическими гидрофобными центрами) гелевой структурой, отсутствием заряженных групп (для исключения образования неспецифических электростатических связей) и достаточной химической, механической, микробиологической стойкостью. В качестве таких сорбентов широко применяют модифицированные агарозы (недостаток: низкая механическая и микробиологическая стойкость, дороговизна). Гель-фильтрация проводиться на сефадексах – модифицированных производных линейного полисахарида декстрана. Для разделения |