Высшее образование
жүктеу/скачать 5 Mb.
|
- Бұл бет үшін навигация:
- 3.5. БИОТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ ВТОРИЧНЫХ МЕТАБОЛИТОВ
- 3.5.1. Получение антибиотиков
| I
I 3-Фосфоглицериновый 1ИН0ВЫЙ Алифатические кислоты Фумарат 1 лиоксилат -«— Изошггоат Сукцинил-КоА- ингибирование Рис. 3.5. Схема биосинтеза лимонной кислоты синтазы тормозится НАДН и сукцинил-КоА. Скорость оборота цикла Кребса определяется поддержанием необходимого уровня окисленных форм коферментов дегидрогеназ (НАД+ и ФАД; см. уравнение реакции), поэтому высокий выход цитрата получается лишь при условии хорошей аэрации. Накопление в культуральной среде существенных количеств цитрата — промежуточного соединения цикла Кребса — невыгодно для организма и является следствием дисбаланса метаболизма или нарушения его генетической природы. Рост культуры грибов обычно регулируют путем изменения содержания фосфата, ионов марганца, железа и цинка в среде. Дефицит фосфата ведет к сверхпродукции цитрата. Роль ионов металлов не до конца установлена. Считают, что дефицит ионов металлов влияет на свойства клеточных мембран и морфологию гиф. Процесс ферментации, ведущий к образованию лимонной кислоты, проводят при низких значениях рН (3—4), что облегчает поддержание стерильных условий ферментации и уменьшает возможность образования побочных продуктов. В более щелочной среде происходит накопление щавелевой и глюконовой кислот. Предполагают, что в кислой среде стимулируется гликолиз, что обеспечивает направление потока углерода в цикл Кребса. Питательные среды для культивирования продуцентов лимонной кислоты в качестве источника углерода содержат дешевое углеводное сырье: мелассу, крахмал и глюкозный сироп. Гриб A. niger чаще всего выращивают на мелассе. Гриб Trichoderma viride синтезирует значительные количества цитрата из глюкозы, что позволяет использовать для этого процесса целлюлозу. Предложены штаммы бактерий (Corynebacterium, Arthrobacterium и Brevibacterium) и дрожжей рода Candida, осуществляющие процесс на основе н-парафинов (С9—С30), которые пока широко не внедрены в промышленность. Существует несколько технологических вариантов промышленного производства лимонной кислоты. Первоначально был разработан вариант процесса, основывающийся на поверхностной ферментации, позднее — на глубинном культивировании. Последнее ведется в две стадии: на первой стадии идет рост мицелия, а на второй, после выхода культуры в стационарную фазу — интенсивный синтез лимонной кислоты. В конце ферментации массу мицелия отделяют путем фильтрования и промывают. Затем при рН < 3,0 в виде кальциевой соли осаждают щавелевую кислоту, а из маточного раствора выделяют лимонную кислоту в форме средней соли, кристаллизующейся в комплексе с четырьмя молекулами воды. Свободную кислоту выделяют из промытых кристаллов соли после их обработки сульфатом кальция. Высокоочищенные препараты лимонной кислоты получают после дополнительной процедуры очистки методом ионообменной хроматографии. Выход продукта составляет 85 %. С 20-х годов XX в. налажено промышленное производство D- глюконовой кислоты из глюкозы при участии A. niger. При этом за 48 ч ферментации культуры гриба степень превращения субстрата составляет 90 %. Глюконат натрия, в виде которого обычно выделяют глюконовую кислоту, используют для извлечения металлов, борьбы со ржавчиной, как моющее средство и в качестве медицинского препарата. С участием культуры грибов из рода Aspergillus путем ферментации глюкозы получают с высоким выходом ита- коновую кислоту, использующуюся для производства пластмасс и красителей. Новые возможности для интенсификации производственных процессов получения органических кислот открывает применение иммобилизованных ферментов и клеток микроорганизмов. 3.5. БИОТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ ВТОРИЧНЫХ МЕТАБОЛИТОВ Принципы получения вторичных метаболитов основаны на особенностях их образования клетками микроорганизмов. Биосинтез вторичных метаболитов фазоспецифичен и происходит по завершении стадии роста, в идиофазе, благодаря чему их еще называют идиолитами (см. с. 32). Среди вторичных метаболитов ведущее место по объему производства занимают антибиотики. 3.5.1. Получение антибиотиков В мире ежегодно производится антибиотиков почти на 20 млрд долларов. К числу антибиотиков относятся важнейшие противо- микробные и противоопухолевые препараты. Открытие антибиотиков произвело переворот в лечении инфекционных заболеваний. Ушли в прошлое представления о неизлечимости многих бактериальных инфекций (туберкулез, сепсис, сифилис и др.). Антибиотики применяют в ряде отраслей народного хозяйства (растениеводство, животноводство, ветеринария, пищевая промышленность и др.), где они используются более широко, чем в медицине. Организация крупномасштабного производства антибиотиков сыграла решающую роль в становлении промышленной биотехнологии. К антибиотикам относятся низкомолекулярные эффекторы изначально природного происхождения, способные подавлять рост живых клеток. Антибиотики, продуцируемые растительными объектами, называют фитонцидами. Вопрос о физиологических функциях антибиотиков, их месте в метаболизме и процессах эволюции окончательно не решен. Антибиотики возникли в борьбе за существование почвенных биоценозов, поэтому многие из них служат средствами нападения и защиты, т. е. представляют собой своеобразное химическое «оружие» клетки. Однако эти функции у антибиотиков не единственны. Известно, что они могут участвовать в процессах детоксикации вредных метаболитов, контролировать некоторые стороны обмена веществ и целые процессы развития, например дифференцировку клеток, служить запасными питательными веществами. Некоторые исследователи рассматривают антибиотики как случайные вещества, обладающие полезными свойствами, другие считают их реликтовыми молекулами, вытесненными в ходе эволюции продуктами рибосомального синтеза, но и до сих пор сохранившими способность вмешиваться в биохимические процессы. Способность нитчатого гриба зеленой плесени Penicillium notatum вызывать гибель микроорганизмов впервые была установлена в 1928 г. английским микробиологом А. Флеммингом. Однако лечебные свойства этой плесени были описаны еще в 1871 г. русским дерматологом А. Г. Полотебновым. Количество открываемых антибиотиков постоянно растет. В 1940 г. было известно всего 6 антибиотиков, а в настоящее время описано более 12 000 аналогичных соединений, из которых в клинике применяют около 200 препаратов. 97 % известных антибиотиков токсичны, поэтому в практике не используются. В химическом отношении они представляют сборную группу органических веществ. В зависимости от химической природы и ряда других свойств известные антибиотики делят на ряд классов: Р-Лактамные (пенициллины, цефалоспорины) составляют более 50 % рынка антибиотиков. Тетрациклины (тетрациклин, морфоциклин, метациклин). Макролиды (эритромицин, олеандомицин). Аминогликозиды (гентамицин, амикацин). Гликопептиды (ванкомицин, ристомицин). Амфениколы (левомицетин). Линкосамиды (линкомицин). Полиеновые [противогрибковые (нистатин, леворин)]. Противоопухолевые (блеомицин) и др. Большой вклад в установление структуры ряда антибиотиков внесли М. М. Шемякин, Ю. А. Овчинников, В. Т. Иванов, А. С. Хохлов, Г.Б.Локшин, М.Н.Колосов, Ю.А.Берлин, Е.С. Есипов, А.Д. Кузовнов. Химические формулы наиболее распространенных антибиотиков следующие: S СН2—СО—NH СН3 СООН 0=С N О но^ сн,
-СН(ОН)-СН-СН2ОН сн 0,N Стрептомицин лш ЛЛ Левомицетин II NH H,N—С—N HN-CO-CHC1, ОН л = СН2ОН у = CH3NH Тетрациклин Грамицидин По типу действия антибиотики делят на бактерицидные (лак- тамные, аминогликозиды), вызывающие гибель микроорганизмов, и бактериостатические (макролиды, тетрациклины, левомицетин), нарушающие способность микроорганизмов делиться. По спектру действия различают антибиотики узкого и широкого действия. К последним относят тетрациклины, макролиды, аминогликозиды, которые особенно полезны в случае неидентифицированных возбудителей болезни, однако при длительном применении они вызывают у пациентов дисбактериоз. В последние годы достигнуты большие успехи в расшифровке молекулярного механизма действия антибиотиков. Наиболее яркая особеннность антибиотиков — исключительная специфичность их действия. По выражению П. Эрлиха, антибиотики — это магические пули. Специфика действия их состоит в избирательном подавлении этими эффекторами одного или нескольких процессов лишь у некоторых микроорганизмов. Таким образом, антибиотики блокируют метаболические мишени в клетках-мишенях. В зависимости от специфики действия антибиотиков на молекулярном уровне различают следующие группы соединений, вызывающие у бактерий: нарушение биосинтеза пептидогликанов клеточной стенки (пенициллины, ванкомицин, цефалоспорины); нарушение отдельных этапов процессов трансляции (амфени- колы, аминогликозиды, тетрациклины, макролиды, линкосамиды); повреждения цитоплазматической мембраны (грамицидин, полимиксины) ; нарушение биосинтеза нуклеиновых кислот (рифамицины, актиномицин D, противоопухолевые антибиотики); нарушение энергетического обмена (олигомицин, хлоргек- сидин). Антибиотики широко используют в качестве молекулярных инструментов при исследовании фундаментальных проблем биологии, таких, как расшифровка тончайших механизмов биосинтеза белка, нуклеиновых кислот и структуры клеточных стенок бактерий, создание моделей транспорта ионов через биологические мембраны и др. Изыскание новых антибиотиков обусловлено как потребностями практики, так и накоплением резистентных форм микроорганизмов по отношению ко многим антибиотикам. Устойчивость бактерий к пенициллинам и цефалоспоринам создает присутствующий в их клетках энзим лактамаза (пенициллиназа). Фермент гидролизует амидную связь (3-лактамного цикла в молекуле антибиотика с образованием пенициллиновой кислоты, которая полностью лишена антимикробной активности: О Н Пенициллиновая кислота Пенициллин Специальное изучение объема и потенциала защитных свойств микроорганизмов показало, что их резистентность к антибиотикам имеет глобальный характер и обеспечивается как разнообразием фенотипов резистентности, так и разнообразием и стабильностью систем горизонтального генного транспорта. Поэтому главное направление получения новых антибиотиков состоит не в открытии новых соединений, а в химической трансформации природных молекул для создания полусинтетических антибиотиков, характеризующихся значительно меньшей резистентностью и токсичностью, но более широким спектром действия, большим временем жизни, химической и биологической устойчивостью. Важный подход на пути получения устойчивых аналогов антибиотиков — использование природных ингибиторов (3-лактамаз — кла- вулановой и оливановой кислот.Методы получения антибиотиков путем химического синтеза чрезвычайно сложны и не могут конкурировать с их биосинтезом методами биотехнологии. Существует несколько способов получения как природных, так и полусинтетических антибиотиков. Направленный биосинтез антибиотиков осуществляется путем прямой ферментации микроорганизма — продуцента с подходящи м нии природы его ацильнои группировки при сохранении в неизменном виде ядра пенициллина — 6-аминопенициллановой кислоты (6-АПК). В промышленности 6-АПК получают путем гидролиза природных пенициллинов с помощью специфического фермента — пенициллинацилазы, образующейся с высоким выходом в процессе ферментации ряда штаммов микроорганизмов. Аци- лазы различают по их субстратной специфичности. Некоторые из ацилаз способны катализировать и обратные реакции — процессы ацилирования аминогруппы 6-АПК с образованием модифицированного пенициллина. Таким путем было получено более 40 ООО полусинтетических пенициллинов. Существенно, что во многих случаях 6-АПК не выделяют из культуральной жидкости, например при превращении бензилпенициллина в ампициллин: |