Министерство сельского хозяйства республики казахстан
жүктеу/скачать 7,26 Mb. Pdf көрінісі
|
- Бұл бет үшін навигация:
- Материалы и методы исследования
- Результаты исследований и их обсуждение
- Keywords
- Ключевые слова
- Результаты исследования
Целью работы было внедрение метода трансплантация эмбрионовв племенном хозяйстве ТОО «Байсерке-Агро»Талгарского района Алматинской области,изучение динамики содержания прогестерона в сыворотке крови у коров в начальной стадии стельности.
Работа проводилась в 2015 году на молочном комплексе племенного хозяйства «Байсерке-Агро» в рамках реализации научного проекта МОН РК «Интенсификация селекционного процесса в животноводстве на основе использования клеточных репродуктивных технологии», № госрегистрации 0115РК00728, на коровах голштинской породы зарубежной селекции. Суперовуляцию у коров доноров проводили по следующей схеме: 0 день интравагинальное введение препарата CIDR, 4-й день – утром и вечером внутримышечное введение препарата Pluset в дозе 150 ЕД, 5-й день – утром и вечером внутримышечное введение препарата Pluset в дозе 125 ЕД, 6-й день - утром и вечером внутримышечное введение препарата Pluset в дозе 100 ЕД, двухкратное внутримышечное введение эстрофана по 2 мл, 7-й день – извлечение из влагалища препарата CIDR, 8-й день – двухкратное искусственное осемнение коров доноров и 9-й день – утром однократное искусственное осеменение коров, 15-й день – вымывание эмбрионов у доноров нехирургическим способом. В Вымывание эмбрионов у коров-доноров проводили на 7-й день нехирургическим способом с помощью двухканального катетераNeustadt/Aisch CH15 компании MiniTube, при этомиспользовали питательную среду Дюльбекко по 450 мл для вымывания каждого рога матки. Для отбора предимплантационных эмбрионов использовали стерильную систему фильтров EmSafe для вымывания эмбрионов у коров с интегрированным фильтром и чашкой Петри с сетчатой номограммой, величина пор 65 μl. Перед вымыванием эмбрионов обследовали коров-доноров трансректальной пальпацией и ультразвуковым сканированием. При этом определяли топографию матки, шейки матки и яичников, устанавливали количество желтых тел и неовулировавших фолликулов на яичниках. УЗИ исследование яичников коров доноров проводили с помощью ультразвукового аппарата PU 2200. Фиксировали яичники коров между указательным и большим пальцем и определяли количество желтых тел и фолликулов по интенсивности эхограммы на дисплее сканера. 224
На эхограмме были хорошо видны неовулировавшие фолликулы в виде фолликулярных кист с диаметром около 0,4-0,6 см, округлой или овальной формы, фолликулярная жидкость на эхограмме дает темный равномерный фон, при этом была четко видна граница ткани яичника и фолликулярной кисты. На эхограмме желтое тело имеет более интенсивную эхогенность, в зависимости от плотности ткани, на дисплее беловатого цвета образование, часто овальной или округлой формы изображения. Анализ образцов сыворотки крови коров 4-й, 7-й и 19-й дни эстрального проводился в лаборатории ТОО «ЭКВИ-ЛАБ». Сбор образцов крови проводился с 9 сентября 2015 года, с целью исключения отрицательного влияния теплового стресса на оплодотворяемость коров. Определение количества прогестерона в образцах сыворотки проводилось на иммуноферментном анализаторе«ImmunoChem-2100» производства США, согласно протокола с использованием набора реагентов для иммуноферментного определения прогестерона в сыворотке (плазме) крови «Прогестерон –ИФА» производства России.
Нами проведено исследование динамики содержания в сыворотке крови коров реципиентов гормона прогестерона и изучение влияния этого показателя на приживляемость эмбрионов. Были взяты образцы крови от 10 доноров и от двух коров после искусственного осеменения и от двух стельных коров. Получены интересные результаты по содержанию прогестерона в крови у телок реципиентов. Так, у стельных животных (реципиентов) наблюдалась тенденция повышения концентрации гормона прогестерона в течениие всего периода мониторинга, т.е. на 4-й, 7-й и 19-й дни полового цикла (рис.1).
Рисунок 1. Динамика содержания прогестерона в сыворотке крови у коров реципиентов на 4-й, 7-й и 19-й дни эстрального цикла.
У реципиентов, у которых зарегистрировались эмбриональные потери мы наблюдали стабильное снижение концентрации прогестерона. Здесь трудно определить, что эмбрион погиб в результате низкой концентрации прогестерона или неправильной техники выполнения пересадки эмбрионов, или под действием других отрицательных факторов.Считаем, что использование данного способа позволяет, уже на 4-й и 7-й дни полового цикла и на момент пересадки эмбрионов (7-день полового цикла) у реципиентов 0 2 4 6 8 10 12 14 16 4-й день
7-й день 19-й день 0,294 0,293
0,248 1,85
3,34 6,4
2,398 7,377
15,345 Количество прогестерона ng/m
l 225
прогнозировать результаты пересадки эмбрионов, т.е. в случае обнаружения тенденции снижения количества прогестерона на 4-й, 7-й дни полового цикла, таких реципиентов следует выбраковать, как непригодных для пересадки эмбрионов. Животные с высоким содержанием прогестерона (более 2,0 ng/ml) являются потенциальными реципиентами. Количество желтых тел при трансректальной пальпации и УЗИ сканирования не соответствует, так как при ректальной проверке дифференцировать желтое тело от неовулировавших фолликулов достаточно сложная процедура. Методика ректального исследования яичников, определение количества неовулировавших фолликул и наличие желтых тел основана на пальпации их поврехности путем подсчета количества бугристых образований. Так определяется количество уже сформированных желтых тел, а также по наличий флюктуаций – фолликулярные кисты. Заключение Результат пересадки эмбрионов у коров реципиентов зависит прежде всего от синхронности полового цикла коров доноров и реципиентов. В качестве критерия оценки физиологического состояния коров реципиентов рекомендуется определение количества прогестерона в сыворотке крови у реципиентов на 4-й и 7- й дни полового цикла, так как животные с высоким содержанием прогестерона (более 2,0 ng/ml) являются потенциальными реципиентами. Одной из причин низкого выхода пригодных для пересадки эмбрионов у коров доноров является наличие фолликулярных кист (неовулировавшие фолликулы) и неоплодотворенных ооцитов.
1. John F. Hasler. BOVINE EMBRYO TRANSFER: ARE EFFICIENCIES IMPROVING? Proceedings, Applied Reproductive Strategies in Beef Cattle December 3-4, 2012; Sioux Falls, SD. P 319-340 2 Robinson RS., Hammond AJ.,Wathes DC., Hunter MG., Mann GE. Corpus luteum- endometrium-embryo interactions in the dairy cow: underlying mechanisms and clinical relevance. ReprodDomestAnim 2008;43 (Suppl. 2): 104-112 3. Lamming GE., Darwash AO., Back HL Corpus luteum function in dairy cows and embryo mortality. J Reprod Fertil 1989; Suppl 37:245-252 4. Mann GE., Lamming GE., Fray MD. Plasma oestradiol and progesterone during early pregnancy in the cow and the effects of treatment with buserelin. AnimReprodSci 1995; 37: 121- 131
5. Buttlerисоавт., 1996; Buttler WR., Calaman JJ., Beam SW. Plasma and milk urea nitrogen in relation to pregnancy rate in lactating dairy cattle. J AnimSci 1996;74:858-865 6. Green MP., Hunter MG., Mann GE. Relationship between maternal progesterone secretion and embryo development on day 5 of pregnancy in dairy cows.AnimReprodSci 2005;88:179-189 7. Pieterse MC., Szenci O., Willemse AH., Bajcsy CSA., Dieleman SJK., Taverne MAM. Early pregnancy diagnosis in cattle by means of linear-array real-time ultrasound scanning of the uterus and a qualitative and quantitative milk progesterone test.Theriogenology 1990; 30(3):697- 707. 8. Медведев Г.Ф., Гавриченко Н.И., Кухтина О.Н., Каплунов В.Р. Пути повышения оплодотворяемости коров с синдромом «повторения половой охоты». Материалы Международной научно-практической конференции, посвященной 45-летию ГНУ ВНИВИПФиТ Россельхозакадемии – «Проблемы и пути развития ветеринарии высоко технологичного животноводства». 1-2 октября 2015 г. Воронеж. Стр 297-303 226
Беркинбай Ж.О.,Кунанбекова А.С., Оспангали Д.С., Еспанов Ж.У., Усенбеков Е.С. РЕЦЕПИЕНТ СИЫРЛАРДЫҢ ҚАН САРЫСУЫНДА ПРОГЕСТЕРОН ГОРМОНЫН ИММУНОФЕРМЕНТТІК ТАЛДАУ ƏДІСІМЕН АНЫҚТАУ
Мақала авторларырецепиент сиырлардың физиологиялық жағдайын анықтауға қосымша балау көрсеткіші ретінде қан саысуындағы прогестерон горомонының мөлшерін олардың жыныстық циклінің 4-ші жəне 7-ші күндері анықтауды ұсынады, себебі қан сарысуында прогестеронның мөлшері жоғары сиырлар ең қолайлы реципиенттер болып табылады (2,0 ng/ml жəне жоғары). Донор сиырларда көшіріп қондыруға жарамды эмбриондардың мөлшерінің төмен болуы овуляцияға ұшырамай қалған фолликулдер мен ұрықтанбаған ооциттер есебінен. Кілт сөздер: прогестрон, иммуноферменттік талдау, суперовуляция, эмбриондарды трансплантациялау, реципиенттер.
Berkinbay J.O.,Kunanbekova A.S., Ospangali D.S., Espanov J.U., Ussenbekov Y.S. DETERMINATION OFPROGESTERONEIN SERUMOF COWSRECIPIENTSELISA
The authors recommended as a criterion for evaluating the physiological state of the recipient cows determining the amount of progesterone in the serum of recipient cows at 4 and 7 th days of sexual cycle, as animals with high progesterone (more than 2,0 ng / ml) are potential recipients. Using ultrasound scans of the ovaries of cows donors to determine the quantity and quality of corpora lutea and the number of follicular cysts. The reason for the low yield suitable for embryo transfer in cows donors is the presence of follicular cysts and unfertilized oocytes. Keywords: Progesterone ELISA, superovulation, ultrasound scans of the ovaries, echogram, donors, recipients.
Жансеркенова О.О., Усенбеков Е.С. Казахский национальный аграрный университет Ульсанский национальный институт науки и технологии,Ульсан, Южная Корея ВЫЯВЛЕНИЕ НОСИТЕЛЕЙ ДЕФИЦИТА XI ФАКТОРА СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ
Авторами статьи проведен мониторинг племенных быков-производителей и коров голштинской породы на носительство генетического заболевания – дефицита XI фактора свертывания крови. Авторы рекомендуют для детекции инсерции нуклеотидных последовательностей, размером 76 п.н. использовать метод полимеразной цепной реакции. По результатам исследования (N= 86) гомозиготных и гетерозиготных носителей генетического дефекта – дефицита XI фактора свертывания крови не выявлены. 227
Ключевые слова: дефицит XI фактора свертывания крови, аутосомальная рецессивная болезнь, инсерция, репродуктивная функция коров.
По сведениям OMIA – ONLINEMENDELIANINHERITANCEINANIMALSкатолога у крупного рогатого скота в настоящее время выявлено 462 генетически обусловленных морфологических и функциональных нарушений и из них 46 наследственных аномалийможно идентифицировать с помощью молекулярно-генетических методов. Своевременная диагностика данных мутаций и выбраковка животных и племенного материала, а также требования генетического паспорта при закупке скота, эмбрионов, замороженной спермы позволяют элиминировать наследственные заболевания. Дефицит XI фактора свертывания крови крупного рогатого скота является аутосомальным рецессивным наследственным генетическим дефектом. Впервые данная патология была зарегистрирована в 1969 году у коров голштинской породы. Часто, этиологическим фактором большинства скрытых генетических дефектов у животных являются точечные мутации в кодирующей части соответствующих генов. Известно, что генетический дефект, дефицит XIфактора свертывания крови крупного рогатого скота (FXID)наоборот является последствием вставки нуклеотидной последовательности в составе экзона 12 гена FXI длиной 76 пар оснований. В результате инсерции появился STOPcodon (TAA)[1]. Высокая скорость распространения вредных мутаций определяется рецессивным характером их наследования. Продукты таких генов, как правило, участвуют в регуляции тканеспецифичныхфункций и неблагоприятные эффекты мутантного аллельного варианта компенсируются в гетерозиготе нормальной функцией аллеля дикого типа. Селекция на уровне фенотипа является неэффективной в связи с низкой частотой гетерозигот по отношению к гомозиготам. Фенотипически, дефицит XI фактора (FXID) свертывания крови у телят характеризуется длительным кровотечением из пупочного канатика, анемией. У коров, гетерозиготных носителей дефицита XI фактора свертывания крови молозиво розового цвета, обычно, такие животные воспримчивы пневмонии, маститам и эндометритам [2]. Исследованиями ученых Турции установлено, что дефицитFXI фактора свертывания крови у коров негативно влияет на репродуктивную функцию коров, в частности у таких животных снижается рост фолликулов и половой цикл сопровождается снижением пиковой концентрации эстрадиола в крови животных. У коров, гомозиготных и гетерозиготных носителей генетического дефекта XIфактора свертывания крови низкие показатели воспроизводительной функции, часто встречаются трудные отелы и рождение нежизнеспособных телят [3]. В настоящее время молекулярно-генетические основы генетических дефектов крупного рогатого скота достаточно хорошо изучены, на основании этих исследований разработаны методы диагностики наследственных заболеваний. Все наследственные заболевания животных в той или иной степени связаны с нарушением репродуктивной функции у коров, снижением резистентности организма телят, у носителей мутации генетического дефекта часто регистрируются эмбриональная смертность, повышение индекса осеменения в результате ранней смертности предимплантационных эмбрионов в период стельности [4]. Целью работы была разработка метода идентификации дефицита XIфактора свертывания крови методом полимеразной цепной реакции и изучение распространенности данной патологии у популяции крупного рогатого скота Акмолинской и Алматинской областей.
228
Исследования проводились на 35 племенных быках АО «Асыл-Тулик» и на 24 быках ТОО «Асыл» и 37 коровах голштинской породы ТОО «Байсерке-Агро» в рамках реализации проекта «Мониторинг племенных животных Республики Казахстан на носительство генетических дефектов с помощью молекулярно-генетических методов» в учебно-научно-диагностической лаборатории Казахстанско-Японского инновационного центра Казахского национального аграрного университета. В качестве материала для исследования были использованы замороженная сперма быков и периферическая кровь коров. ДНК из крови коров и спермы быков выделяли с помощью набора «ДНК сорб В». При выделении ДНК из замороженной спермы с целью оптимизации и выделения более качественной ДНК нами был использован способ предварительной обработки спермы следующим образом: вносили в пробирку 200 мкл спермы, затем добавляли 1 мл лизирующего буфера, имеющий состав 100 мМТрис, 20 мМ ЭДТА, 10 мМNaCI, рН 8,0 и перемешивали в течение 30 секунд, далее центрифугировали g 10000 об/мин в течение 5 минут. После центрифугирования, суспендировали осадок в 500 мкл буфера: 100 мМТрис, 20 мМ ЭДТА, 10 мМNaCI, рН 8,0 и добавляли 8 мкл 2- меркаптоэтанола. Затем перемешивали навортексе в течение 1 минуты и оставляли на 30 минут при комнатной температуре. Рисунок 1. Электрофореграмма продукта амплификации участка гена FXI. Полимеразную цепную реакцию проводили на термоциклере «Терцик» производства России. Для детекции носителей дефицита XI фактора свертывания крови использовали праймеры: F- 5′- CCCACTGGCTAGGAATCATT- 3′ и R- 5′- CAAGGCAATGTCATATCCAC - 3′. Использование данной пары праймеров позволяет амплифицировать фрагмент гена FXID размером 244 п.н. у здоровых гомозиготных животных, 244 п.н. и 320 п.н. у гетерозиготных носителей и 320 п.н. у гомозиготных носителей генетического дефекта (рис 1). Условия проведения ПЦР: первый шаг - денатурация ДНК при температуре 95 °С – 10 минут, второй шаг 35 циклов, денатурация при 95 °С – 30 сек, отжиг праймеров – 55 °С 60 сек и элонгация при температуре 72 °С 30 сек. Завершающий синтез при 72 °С продолжительностью 10 мин. Хранение при +4 °С. Объем реакционной смеси был 50 мкл, имеющий следующий состав: 5 мкл 10 Х буфера для ПЦР, 1,5 мМ MgCl2, 2,5 мкл 25 мкМ прямого и обратного праймеров, 5 мкл 0,2 мМ концентрации каждого dNTP, 0,5 мкл фермента TaqPolymerase с активностью 5u/μl, 5 мкл ДНК и 26,5 мкл дистиллированной воды.
Результаты исследования В нашей работе для выделения ДНК из спермы быков-производителей и из периферической крови коров был использован метод экстракции ДНК с помощью набора «ДНК сорб В». Амплификация нужного фрагмента гена FXID проводилась с использованием прямого и обратного праймеров в течение 35 циклов. ПЦР диагностика
229
данного генетического дефекта основана так, что у здоровых гомозиготных животных при амплификации образуется один бэнд размером 244 п.н., в случае гетерозиготного носительства появляется, в результате инсерции (вставки нуклеотидных последовательностей 76 п.н.) образуется второй бэнд размером 320 п.н. Нами были тестированы методом полимеразной цепной реакции 59 голов племенных быков-производителей и 37 голов коров голштинской породы Канадского происхождения ТОО «Байсерке-Агро». На электрофореграмме хорошо видны полоски ДНК размером 244 п.н, лунки (1-13) илунка М - ДНК маркер плазмидаpUC19DNA (рис.1), рестрицированнаяэндонуклеазой MspI. Данный ДНК маркер имеет, фрагменты длиной 501,489, 404, 331, 242, 190, 147, 111, 110, 67, 34, 34 и на электрофореграмме четко видно, что амплификат размером 244 п.н. идет на уровне 242 п.н. ДНК маркера.Предварительные результаты исследований свидетельствуют, что среди исследуемых животных отсутствуют носителигенетического дефекта – дефицита XIфактора свертывания крови крупного рогатого скота (FXID). Заключение В последнее время Республика Казахстан ежегодно в большом объеме закупает живой племенной скот и замороженную сперму племеных быков-производителей зарубежной селекции. В связи с вышеизложенным, считаем необходимым проведение мониторинга всего племенного поголовья на носительство данного наследственного заболевания, так как у гетерозиготных носителей дефицитаXIфактора свертывания не проявляются клинические признаки этого генетического дефекта.
1.
Marron B.M., Robinson J.L., Gentry P.A., Beever J.E.Identification of a mutation associated with factor XI deficiency inHolsteincattle.Anim Genet. 2004 Dec;35(6):454-6. 2.
H.,Kunieda T. (2005) An insertion mutation of the bovine F11 gene is responsible for factor XI deficiency in Japanese black cattle. MammGenom 16:383-389. 3.
deficiency inHolsteincattle in Turkey. Acta Vet Scand. 2009, Jan 22;51:5. 4.
PatelR K.,SoniK.J., ChauhanJ.B.,. SinghK.M.,Krothapalli R.S. SambasivaRaoFactor XI deficiency in Indian Bostaurus, Bosindicus, Bostaurus x Bosindicus crossbreds and Bubalus bubalis. Genet. Mol. Biol. São Paulo 2007.,vol.30 no.3
Бименова Ж.Ж., Сериков А.Е., Касымбекова Ш.Н., Жансеркенова О.О., Усенбеков Е.С. ҚАН ҰЮЫНЫҢ XI ФАКТОРДЫҢ ЖЕТІСПЕУШІЛІГІН ПОЛИМЕРАЗДЫҚ ТІЗБЕК РЕАКЦИЯСЫ КӨМЕГІМЕН АНЫҚТАУ
Мақалада голштеин тұқымдас асыл тұқымды бұқалар мен сиырларда генетикалық патология – қан ұюының XI фактордың жетіспеушілігінің таралуына мониторинг жүргізілген. Фенотиптік жағынан қан ұюдың XI факторының жетіспеушілігі келесідей клиникалық белгілермен байқалады: эндометриттер, желінсаулар жəне жоғарғы ұрықтану индексі. Авторлар нуклеотидтер тізбектерінің инсерциясының, ұзындығы 76 ж.н., балауға полимераздық тізбек реакциясы мен 3%-дық агарозаның горизонтальдық электрофорезін қолдануды ұсынады. Зерттеу нəтижелері бойынша (N= 86) гомозиготалы жəне гетерозиготалы қан ұюының XI фактордың жетіспеушілігінің тасымалдаушылары табылмады. Кілт сөздер. қан ұюының XI фактордың жетіспеушілігі, аутосомальдық рецессивтік ауру, инсерция, сиырлардың репродуктивтік қызметі.
230
Bimenova Zh.Zh., Serikov A.Y., Kasymbekova Sh.N., Zhanserkenova О.О., Ussenbekov Y.S. CARRIER DETECTIONFACTORIXDEFICIENCY BLOOD COAGULATIONUSING POLYMERASE CHAIN REACTION
The authors monitored the breeding sires and Holstein cows on the carrier of the genetic disease - deficiency of coagulation factor XI. Phenotypically deficiency of coagulation factor XI in cows accompanied endometritis, mastitis and high index of insemination. The authors recommend to detect the insertion of nucleotide sequences of 76 bp use the polymerase chain reaction and a horizontal 3% agarose electrophoresis. According to the study (N = 86) homozygous and heterozygous carriers of a genetic defect - deficiency of coagulation factor XI were not identified. Keywords: deficiency of coagulation factor XI, autosomal recessive disease, insertion, reproductive function of cows.
жүктеу/скачать 7,26 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|