СОНАЛАРМЕН КҮРЕС ӘДІСТЕРІ

280 
 
Таблица 1 – Характеристика бруцелл. 
 
Виды 
Болезнь 
Brucella melitensis (биовары 1-3) 
Бруцеллез коз, овец, человека 
Brucella abortus (биовары 1-6,9) 
Бруцеллез крупного рогатого скота, человека 
Brucella suis (биовары 1-5) 
Бруцеллез свиней, человека 
Brucella canis 
Бруцеллез собак 
Brucella ovis 
Бруцеллез овец (эпидидимит у баранов) 
Brucella neotomae 
Бруцеллез крыс, морских свинок, мышей 
 
Несовершенство  мер  борьбы,  диагностики  и  профилактики,  с  указанной  инфекцией, 
социальная  опасность  болезни,  требуют  разработки  более  действенных  мер  с  учетом  технологии 
животноводства,  многоукладности  форм  хозяйствования.  Предотвращение  эпизоотии  позволяет 
поддерживать  и  развивать  необходимые  межхозяйственные,  межрегиональные  и  государственные 
связи,  а  успешная  борьба  с  болезнями  животных,  опасных  для  человека,  обеспечивает  охрану 
здоровья  населения  страны.  Согласно  данным  Западно-Казахстанской  областной  территориальной 
инспекции  Комитета  ветеринарного  конртоля  и  надзора  Министерства  сельского  хозяйства 
Республики  Казахстан  процент  заболеваемости  бруцеллезом  среди  крупного  рогатого  скота  по 
области  составил  в  2014  –  1,79%,  тогда  как  годом  ранее  он  составлял  0,3%.  Основным  этапом 
оздоровления  животных  от  инфекционных    болезней,  в  том  числе  и  от  бруцеллеза,  является 
своевременная  и  быстрая  диагностика,  где  важное  место  занимают  лабораторные  исследования  с 
целью  обнаружения  возбудителей  в  патологическом  материале.  Для  обнаружения  возбудителей 
применяют  традиционные  методики  диагностики  серологические,  микробиологические
, 
а  так  же 
современный  метод  диагностики  иммуноферментный  анализ  (ИФА)  и  полимеразно-цепная  реакция 
(ПЦР).  Из  всех  перечисленных  методов  наиболее  перспективный  метод  молекулярной  биологии  – 
ПЦР
, 
поскольку  он  позволяет  идентифицировать  возбудитель  по  уникальному  для  данного  вида 
участку  ДНК,  так  же  он  отличается,  при  умелом  его  исполнении,  более  меньшим  временем, 
затрачиваемым на диагностику. 
Принцип  метода  полимеразной  цепной  реакции  (ПЦР,  Polymerase  chain  reaction,  PCR) был 
разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", США) в 1983 г. Открытие ПЦР  стало одним из наиболее 
выдающихся  событий  в  области  молекулярной  биологии  за  последние  20  лет.  За  разработку  ПЦР-
анализа К.Мюллис в 1993 г. был удостоен Нобелевской премии в области химии. Появление метода 
ПЦР  было  обусловлено  определенными  достижениями  молекулярной  генетики,  прежде  всего 
расшифровкой нуклеотидной последовательности геномов ряда микроорганизмов. Нельзя не сказать, 
что  ПЦР  стала  возможной  благодаря  открытию  уникального  фермента  taq-ДНК-полимеразы, 
содержащегося у бактерий, обитающих в гейзерах. Особенность этой полимеразы заключается в ее 
исключительной  термостойкости  и  высокой  рабочей  температуре.  Кроме  классических  вариантов 
ПЦР  в  современной  молекулярной  биологии  используют  ПЦР  в  режиме  реального  времени.  Она 
позволяет  измерять  количество  амплифицированных  фрагментов  искомой  ДНК  непосредственно  в 
реакционной смеси во время и после окончания реакции. Метод основан на использовании молекул, 
способных  флюоресцировать  при  определенной  длине  волны.  Большинство  коммерческих  наборов 
позволяют  определить  участок  генома  характерный  для  всего  рода  Brucella,  а  для 
эпизоотологических  и  эпидемиологических  целей  иногда  требуется  выявить  непосредственно  вид 
бруцелл [3,4].  
Цель  исследований  –  подобрать  праймеры  для  детекции  B.  abortus  и  проверить 
видоидентифицирующую способность праймеров.     
Работа  выполнялась  на  базе  Научно-исследовательского  института  (лаборатория 
биотехнологии  инженерного  профиля)  ЗКАТУ  имени  Жангир  хана.  Проведение  полимеразной 
цепной  реакции  осуществлялось  на  амплификаторе  iQ5  фирмы  BioRad.  Состав  реакционной  смеси 
включал в себя следующие компоненты: праймеры, зонд, буфер для проведения ПЦР реакции, MgCl 
1.5 M, смесь дизоксинуклеотидтрифосфатов dNTP и Taq-полимераза.   
В качестве объектов исследования были взяты вакцинные штаммы бруцелл 82 и Rev-1.  
Подбор  праймеров  проводили  согласно  литературным  данным  и  на  основе  компьютерного 
анализа  при  помощи  пакета  программ  Vector  NTI.  Видоидентифицирущую  способность  праймеров 
определяли с помощью инструмента «Blast» (
http://blast.st-va.ncbi.nlm.nih.gov/
) [1,5,6]. 

281 
 
В  качестве  референс  системы  по  детекции  бактерий  рода  бруцелл  методом  ПЦР  в  режиме 
«Реального  времени»  была  взята  тест-система  "БРУ-КОМ"  для  выявления  возбудителя  бруцеллеза 
методом полимеразной цепной реакции, каталожный номер VET-9-FRT (iQ). 
Выделение  ДНК  проводили  методом  ЦТАБ.  Качество  выделения  ДНК  определяли  при 
помощи метода электрофореза в агарозном геле.  ДНК из вакцинных штаммов бруцелл выделяли с 
помощью  экстрагирующего  буфера  состоящего  из  2  г.  CTAB  (детергент,  разрушает  клеточные 
мембраны,  образует  комплексы  с  белками  и  кислыми  полисахаридами),  28  мл  5М  NaCl,  4  мл  0,5М 
EDTA  (pH  8.0),  доведенного  дистиллированной  водой  до  100  мл.  К  100  мкл  вакцин  добавляли  300 
мкл  экстрагирующего  буфера  и  инкубировали  при  температуре  60ºC  на  1  час,  периодически 
перемешивая  содержимое  пробирки.  После  инкубации  добавляли  равный  объём  хлороформа  и 
оставляли  на  1  час  при  комнатной  температуре.  Содержимое  пробирки  постоянно  перемешивали. 
Затем центрифугировали 5 мин при 5 000 об/мин. Переносили верхнюю фазу в чистую пробирку и 
добавляли 2/3 объёма изопропилового спирта, перемешали. Пробирки с содержимым оставляли при 
комнатной температуре на 2 часа для осаждения ДНК. Затем центрифугировали 10 минут при 12 000 
об/мин. Супернатант сливали и промывали осадок 70% - этиловым спиртом. Центрифугировали при 
тех  же  условиях.  Затем сливали  надосадочную жидкость,  осадок  просушивали  и  растворяли  в  воде 
свободной от ДНК и РНК. Основная суть методов заключается в том, что нам необходимо сначала 
удалить клеточные оболочки, денатурировать белки, связанные с ДНК, удалить примеси осаждением 
и непосредственно выделить уже очищенную ДНК. 
Качество выделенного ДНК определяли методом электрофореза в агарозном геле. 
Оптимизацию  условий  проведения  полимеразной  цепной  реакции  с  выделенными  ДНК 
велась по температурному и временному профилю реакции, а также по составу реакционной смеси.
  
В ходе исследований были отобраны две пары праймеров Ba si F (5’-ACAC……GCTCAC-3’), 
Ba si R (5’-CAACA……GCG-3’) и зонд (5’-CGGCGC……ACGGGC-3’)для ПЦР в режиме «Реального 
времени».  При  определении  вида  идентифицирующей  способности  праймеров  было  получено,  что 
праймеры на 100% амплифицируются к следующим штаммам B. abortus              (Таблица 2). 
 
Таблица 2 – Штаммы Brucella abortus идентифицируемые праймерами Ba si F и Ba si R. 
 
№ 
Название штамма согласно номенклатуре* 
Идентификационный номер* 
1 
Brucella abortus strain ZW053  
CP009099.1 
2 
Brucella abortus strain 3196 
CP007708.1 
3 
Brucella abortus bv. 2 str. 86/8/59 
CP007764.1 
4 
Brucella abortus strain 63 75 
CP007662.1 
5 
Brucella abortus strain BFY 
CP007737.1 
6 
Brucella abortus bv. 6 str. 870 
CP007710.1 
7 
Brucella abortus bv. 9 str. C68 
CP007706.1 
8 
Brucella abortus strain NCTC 10505 
CP007701.1 
9 
Brucella abortus strain BER 
CP007683.1 
10  Brucella abortus strain BDW 
CP007680.1 
11  Brucella abortus A13334 
CP003177.1 
12  Brucella abortus S19 
CP000888.1 
13  Brucella abortus biovar 1 str. 9-941 
AE017224.1 
Примечание: *по данным Национального центра биотехнологической информации США  
 
Для  определения  наилучшей  температуры  «амплификации»  праймеров  была  составлена 
программа  с  градиентом  температур,  которая  состоит  из  50  циклов  включающая  в  себя  1  этап 
«денатурация» при 95° С в течении 15 секунд,  2 этап «амплификация» при температуре от 52 до 58° 
С в течении 20 секунд и 3 этапа «элонгации» или «синтеза» при 72° С в течении 30 секунд (Рисунок 
1).  
 
 

282 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Рисунок 1 – Результаты ПЦР в режиме «реального времени» с градиентом температур 
«амплификации» 
Результате  постановки  ПЦР  с  градиентом  температур  в  режиме  «реального  времени» 
определили программу ПЦР для идентификации B. abortus состоящую из 50 циклов включающая в 
себя 1 этап «денатурация» при 95° С в течении 15 секунд,  2 этап «амплификация» при температуре 
58° С в течении 20 секунд и 3 этапа «элонгации» при 72° С в течении 30 секунд. 
Для  определения  идентифицирующей  способности  подобранных  нами  праймеров  были 
поставлены  ряд  ПЦР  в  режиме  «реального  времени»:  1  и  3  ПЦР  с  коммерческим  набором  "БРУ-
КОМ" и ДНК из вакцинных штаммов B. abortus 82 и  B. melitensis  Rev-1 соответственно. 2 и 4 ПЦР с 
праймерами  Ba  si  F  и  Ba  si  R  и  ДНК  из  вакцинных  штаммов  B.  abortus  82  и    B.  melitensis   Rev-1 
соответственно.  Пятая  ПЦР  служила  отрицательным  контролем  и  контролем  контаминации  ПЦР 
микса. (Рисунок 2). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Рисунок 2 – Результаты видоидентифицирующей способности праймеров Ba si F и Ba si R для 
ПЦР в режиме «реального времени»  
 
Таким  образом,  в  ходе  проведенного  ПЦР  в  режиме  «реального  времени»  выявлена  строгая 
специфичность  праймеров  Ba  si  F  и  Ba  si  R  к  бактериям  вида  Brucella  abortus  (Рисунок  2  (2)).  
Коммерческий  набор  "БРУ-КОМ"  при  этом  был  родоспецифичен,  что  соответствует 
характеристикам
,
 заявленным в наставлении по применению. 
В  результате  проведенных  исследований  подобрана  пара  праймеров  позволяющих
, 
детектировать  маркерный  участок  генома  бактерий  вида  B.  abortus.  Установлено,  что  методика  на 
основе метода ПЦР в режиме «реального времени» позволяет дифференцировать B. abortus от других 
видов  рода    Brucella  без  применения  культуральных  методов  в  более  короткие  сроки,  что 
немаловажно для практической ветеринарии и медицины. 
 
 
 

283 
 
Литература 
 
1.  Bogdanovich  T.,  Skurnik  M.,  Lubeck  P.S.,  Ahrens  P.,  Hoorfar  J.  Validated  5'  nuclease  PCR  assay  for 
rapid identification of the genus Brucella. // J. Clin. Microbiol. - 2004. - № 42. – P. 2261–2263. 
2.  Boschiroli  M.L.,  Foulongne  V.,  O'Callaghan  D.  Brucellosis:  a  worldwide  zoonosis.  //  Curr  Opin 
Microbiol. – 2001. № 4(1). – P. 58-64. 
3. Bricker B.J. PCR as a diagnostic tool for brucellosis. // Vet. Microbiol. - 2002. – № 90. – P. 435–446. 
4.  Foster  J.T.,  Okinaka  R.T.,  Svensson  R.,  Shaw  K.,  De  B.K.,  Robison  R.A.,  Probert  W.S.,  Kenefic  L.J., 
BrownW.D., Keim P. Real-time PCR assays of single-nucleotide polymorphisms defining the major Brucella 
clades. // J. Clin. Microbiol. - 2008. - № 46. – P. 296–301. 
5. Gandara B., Merino A.L., Rogel M.A., Martinez-Romero E. Limited genetic diversity of Brucella spp. // J. 
Clin. Microbiol. - 2001. - № 39. – P. 235–240. 
6.  Halling  S.M.,  Peterson-Burch  B.D.,  Bricker  B.J.,  Zuerner  R.L.,  Qing  Z.,  Li  L.L.,  Kapur  V.,  Alt  D.P., 
Olsen  S.C.  Completion  of  the  genome  sequence  of  Brucella  abortus  and  comparison  to  the  highly  similar 
genomes of Brucella melitensis and Brucella suis. // J Bacteriol. – 2005 - № 187(8). – P. 2715-2726.  
7. Ko J., Gendron-Fitzpatrick A., Ficht T.A., Splitter G.A. Virulence criteria for Brucella abortus strains as 
determined  by  interferon  regulatory  factor  1-deficient  mice.  //  Infect.  Immun.  -  2002.  –  №  70.  –  P.  7004–
7012. 
 
ПТР-НЫҢ  «ҚАЗІРГІ УАҚЫТ» РЕЖИМДЕ BRUCELLA ABORTUS АНЫҚТАУ 
М.Г. Какишев 
 
Бұл  мақалада  Brucella  abortus  бактерияларының  түрін  анықтайтын  праймерлерді 
тандау  талдау
 
анализ  нәтижелері  көрсетілген.  Праймерлердін  түрін  анықтау  мүмкіндігі 
зерттелді. ПТР-ның  «ағымдағы уақыт» режимде  температурлық профилі бойынша қолайлы 
жағдай белгілері анықталды. 
 
IDENTIFICATION OF BRUCELLA ABORTUS BY REAL-TIME PCR 
M.G. Kakishev 
 
This article presents the results of research on the selection of species-specific primers for bacteria 
species  Brucella  abortus.  The  analysis  species-specific  ability  of  primers.  Optimized  PCR  "real  time"  
conditions on the temperature profile of the reaction.  
 
 
УДК 539.16:637 
 
С.Т. Дюсембаев, А.Т. Серикова, Д.Е. Иминова  
Испытательная региональная лаборатория инженерного профиля "Научный центр 
радиоэкологических исследований", ГУ им. Шакарима г.Семей. 
 
КОЭФФИЦИЕНТЫ ПЕРЕХОДА Cs
137
 В РАСТЕНИЯ И ЖИВОТНОВОДЧЕСКУЮ 
ПРОДУКЦИЮ 
 
Аннотация: В данной статье приведены коэффициенты  перехода радионуклида цезия-137 в 
растения  и  мясо,  молоко  сельскохозяйственных  животных.  Для  этой  цели  в  исследуемых  пунктах 
были отобраны пробы почвы, растений, мяса и молока. Были исследованы содержание радионуклида 
цезия-137  в  этих  пробах  и  рассчитаны  расчетным  методом  коэффициенты  перехода    цезия-137  в 
мясо и молоко  сельскохозяйственных животных. 
 
Ключевые  слова:  Коэффициент  перехода,  радиоактивность,  радионуклид,  период 
полураспада 
 
Основным  из  радионуклидов,  определяющих  радиационную  обстановку  на  загрязненных 
сельскохозяйственных  угодьях,  является  цезий-137.  Система  "почва-растение"  является  главным 
звеном  в  пищевой  цепочке,  обеспечивающей  основное  поступление  радионуклидов  в  организм 
человека. 

284 
 
Цезий-137  -  бета-излучатель  с  периодом  полураспада  30.174  года. В  настоящее  время 
известно  несколько  изотопов  цезия.  Наибольшее  практическое  значение  имеет Сs
137
,  один  из 
наиболее долгоживущих продуктов деления урана[1]. 
Поведение  цезия-137  в  системе  "почва-растение"  имеет  ряд  отличительных  особенностей. 
Содержание  радионуклидов  в  сельскохозяйственной  продукции  зависит  как  от  плотности 
загрязнения,  так  и  типа  почв,  их  гранулометрического  состава  и  агрохимических  свойств,  а  также 
биологических особенностей возделываемых культур. Показатели почвенного плодородия оказывают 
существенное  влияние  на  накопление  радионуклидов  всеми  сельскохозяйственными  культурами, 
особенно  многолетними  травами.  При  повышении  содержания  физической  глины  в  почве  от  5  до 
30%, содержания гумуса от 1 до 3,5% переход радионуклидов в растения снижается в 1,5 - 2 раза, а 
по мере повышения содержания в почве подвижных форм калия и фосфора от низкого (менее 100 мг 
К
2
О на кг почвы) до оптимального (200 - 300 мг/кг) и изменения реакции почв от кислого интервала 
(рН 4,5 - 5,0) к нейтральному (рН 6,5 - 7,0) - в 2 - 3 раза. Минимальный переход цезия-137 в растения 
наблюдается на почвах с оптимальными параметрами агрохимических свойств. 
Еще  большее  влияние  на  накопление  радионуклидов  в  сельскохозяйственной  продукции 
оказывает  режим  увлажнения  почв.  Установлено,  что  переход  радиоцезия  в  многолетние  травы 
повышается в 10 - 27 раз на дерново-глеевых и дерново-подзолисто-глеевых почвах по сравнению с 
автоморфными и временно-избыточно увлажняемыми разновидностями этих почв. Исследованиями 
БелНИИ  мелиорации  и  луговодства  установлено,  что  минимальное  накопление  цезия-137  в 
многолетних травах обеспечивается при поддержании уровня грунтовых вод на глубине 90 - 120 см 
от поверхности осушенных торфяных и торфяно-глеевых почв[2]. 
Растения,  произрастающие  на  полях  и  лугах,  являются  источниками  поступления 
радиоактивного цезия в организм сельскохозяйственных животных и загрязнения получаемых от них 
продуктов (мяса, молока). Мясомолочный скот в сутки поедает траву с очень большой площади — до 
160 м
2
 (на одну корову), а следовательно, радионуклиды интенсивно попадают в организм животных. 
С молоком коров выводится до 1% цезия, поступивший в организм в его суточном рационе.  
Целью  данной  научной  работы  является  –  определение  коэффициента  перехода 
радиоактивного цезия из почвы в растения, из растений в мясо и молоко. 
Для этой цели были отобраны пробы почвы, растений из пастбищ и мясо, молоко крупного 
рогатого скота которые паслись на этих пастбищах. Работа велась в селах Бодене, Сарапан, Абралы, 
Акку,  Кииккашкан,  Бегень,  Жантике  и  в  городе  Семей.  Измерения  проводились  в  испытательной 
региональной  лаборатории  инженерного  профиля  «Науный  центр  радиоэкологических 
исследований».  Проведены  исследования  уровней  и  параметров  перехода  радионуклида  цезия  из 
почвы в растения. Для оценки параметров перехода радионуклида из почвы в растения рассчитаны 
Кп,  величина  которых  для  цезия  в  случаях  отсутствия  количественных  значений  удельной 
активности в пробах растений установлена оценочно. Результаты расчета представлены в диаграмме 
1.  По  определению  коэффициент  перехода  является  отношением  удельного  содержания 
радионуклида в растениях к плотности загрязнения им почвы, занятого этими растениями. Переход 
радионуклида из корнеобитаемого слоя почвы в растения описывается уравнением:  
                                                                     
                                                       Ср = Кп,р × Сп                                                                       (1) 
 
Из этой формулы коэффициент перехода будет равна: 
 
                                  Кп
, р =
Ср
Сп
                                                                                                     (2) 
 
где  Kп,р – коэффициент перехода в цепи «почва–растение»; 
Ср – концентрация радионуклида в растениях; 
Сп – концентрация радионуклида в почве[3]. 
 
 

285 
 
 
 
Диаграмма 1 - Коэффициенты перехода радионуклидов из почвы в растения 
 
Анализ  данных  показал  что  максимальное  значение  коэффициента  перехода  обнаружено  в 
селах  Кииккашкан,  Жантике  и  Акку  -  0,67  и  0,5.  Минимальное  значение  коэффициента  перехода  в  
селах Бодене и Сарапан - 0,044 и 0,057. 
Поступление  радионуклидов  в  растения  сильно  зависит  от  типа  и  минерального  состава 
почвы.  Цезий  хорошо  поглощается  растительностью,  коэффициент  накопления  элемента  в  урожае 
сельскохозяйственных  культур  может  достигать  100%;  накопление  идет  в  основном  в  надземной 
фитомассе  (до  60%  поглощенного  элемента).  Интенсивное  вовлечение  элемента  в  биологический 
круговорот обусловлено кислотностью почвы, благоприятствующих физиологическому накоплению 
металла  организмами,  подвижностью  металла,  а  также  его  аналогией  с  калием  –  биохимически 
активным  элементом,  дефицит  которого  в  степях  ярко  выражен,  но  который  жизненно  необходим 
растениям. 
Коэффициент перехода из растений в молоко представлена в диаграмме 2. 
 
 
 
Диаграмма 2 – Коэффициент перехода Cs
137  
из растений в молоко 
 
В  звене  корм-молоко  коэффициенты  перехода  радионуклида  Cs
137
  максимальное  значение 
выявлено в городе Семей – 4. В селах Акку  – 2,24; Жантике  – 1,34; Бегень   - 0,18; Сарапан  – 0,17; 
Бодене – 0,13; Абралы  - 0,93; Кииккашкан – 0,75. 
 
 
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5

286 
 
 
 
Диаграмма 3 – Коэффициент перехода Cs
137  
из растений в мясо 
 
Из  диаграммы  3  видно,  что  максимальное  значение  перехода  данного  радионуклида  в  мясо 
обнаружено в городе Семей – 3,4. В селах Жантике – 2,8; Кииккашкан – 1,9; Акку -1; Абралы – 0,5; 
Сарапан – 0,08; Бодене – 0,07 и Бегень – 0,05. 

жүктеу/скачать 7,62 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: