Тұқым қуалайтын ауруларға диагноз қою әдістері тақырыбы бойынша ақпараттық-дидактикалық блок
жүктеу/скачать 195,5 Kb.
|
- Бұл бет үшін навигация:
- (MLPA- Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification
| Молекулалық-цитогенетикалық зерттеу-пациенттің генетикалық материалын зерттейтін заманауи диагностикалық әдіс. Молекулалық цитогенетикалық зерттеулер флуоресцентті бояулармен өңделген әртүрлі ДНҚ зондтарын интерфазалық және метафазалық хромосомалармен будандастыруға мүмкіндік береді. Талдау нәтижесінде хромосомалардың сапалық және сандық жиынтығы анықталады. Бұл әдіс денсаулықтың нашарлауына әкелетін микро аберрациялық мутацияларды анықтауға мүмкіндік береді.
Соңғы жылдары спектрлік кариотиптеу деп аталатын әдіс қолданылды (флуоресцентті будандастыру in situ, ағылш. Fluorescence in situ hybridization, FISH) хромосомалардың белгілі бір аймақтарымен байланысатын флуоресцентті бояғыштар жиынтығымен хромосомаларды бояудан тұрады. Осындай бояудың нәтижесінде хромосомалардың гомологиялық жұптары бірдей спектрлік сипаттамаларға ие болады, бұл мұндай жұптарды анықтауды едәуір жеңілдетіп қана қоймайды, сонымен қатар хромосомааралық транслокацияларды, яғни хромосомалар арасындағы учаскелердің алмасуын анықтауды жеңілдетеді — транслокацияланған учаскелерде хромосоманың қалған бөлігінен ерекшеленетін спектр бар. Ол үшін ДНҚ зондтары қолданылады-белгілі нуклеотидтік құрамы бар ДНҚ – ның бір тізбекті фрагменттері (қажетті геннің көшірмесі), олар хромосоманың тиісті бөлігімен комплементарлы байланысады. Флуоресцентті будандастыру in situ (FISH, ағылш. fluorescence in – situ hybridization) - хромосомалық ауытқуларды диагностикалаудың ең заманауи әдістерінің бірі. Ол флуоресцентті таңбаланған ДНҚ үлгілерін пайдалануға негізделген. ДНҚ сынамалары арнайы синтезделген ДНҚ фрагменттері болып табылады, олардың тізбегі зерттелетін аберрантты хромосомалардың ДНҚ тізбегіне комплементарлы болып табылады. Осылайша, ДНҚ сынамалары құрамы бойынша ерекшеленеді: әртүрлі хромосомалық ауытқуларды анықтау үшін әртүрлі, арнайы ДНҚ сынамалары қолданылады. ДНҚ үлгілері де мөлшері бойынша ерекшеленеді, кейбіреулері бүкіл хромосомаға, басқалары белгілі бір локусқа бағытталуы мүмкін. Будандастыру процесінде зерттелетін үлгіде аберрантты хромосомалар болған кезде олардың ДНҚ сынамасымен байланысуы жүреді, ол флуоресцентті микроскоппен зерттелген кезде флуоресцентті сигнал (FISH сынағының оң нәтижесі) ретінде анықталады. Аберрантты хромосомалар болмаған кезде реакция барысында байланыспаған ДНҚ сынамалары "шайылып" кетеді, бұл флуоресцентті микроскоппен зерттеу кезінде флуоресцентті сигналдың болмауы (FISH тестінің теріс нәтижесі) ретінде анықталады. Әдіс флуоресцентті сигналдың болуын ғана емес, оның қарқындылығы мен орналасуын да бағалауға мүмкіндік береді. Осылайша, FISH тесті тек сапалық емес, сонымен қатар сандық әдіс болып табылады. FISH сынағы басқа молекулалық-цитогенетика әдістеріне қарағанда бірқатар артықшылықтарға ие. Ең алдымен, FISH зерттеуін метафазалық және интерфазалық ядроларға, яғни бөлінбейтін жасушаларға қолдануға болады. Бұл тек метафазалық ядроларға қолданылатын классикалық кариотиптеу әдістерімен (мысалы, Романовский-Гимзе хромосомаларын бояу) салыстырғанда FISH -әдісінің басты артықшылығы. Осының арқасында FISH зерттеуі пролиферативті белсенділігі төмен тіндердегі, соның ішінде ісіктердегі хромосомалық ауытқуларды анықтаудың тиімді әдісі болып табылады. FISH сынағы интерфаза ядроларының тұрақты ДНҚ-сын қолданатындықтан, зерттеу үшін әртүрлі биоматериалдарды қолдануға болады-жұқа аспирациялық биопсия, жағындылар, сүйек кемігінің аспираттары, биоптаттар және ең бастысы, сақталған тіндік фрагменттер, мысалы, гистологиялық блоктар. FISH зерттеудің тағы бір артықшылығы-оның классикалық кариотиптеу немесе ПТР арқылы анықталмайтын микроделецияларды анықтау қабілеті. FISH тесті қатерлі аурулардың дифференциалды диагностикасында, ең алдымен онкогематологияда кеңінен қолданылады. Хромосомалық ауытқулар клиникалық көрініспен және иммуногистохимиялық зерттеу деректерімен бірге лимфа және миелопролиферативті ауруларды жіктеудің, емдеу тактикасын анықтаудың және болжаудың негізі болып табылады. Классикалық мысалдар - созылмалы миелолейкоз – t (9;22), жедел промиелоцитарлы лейкемия – t (15;17), созылмалы лимфоцитарлы лейкемия – трисомия 12 және басқалар. Қатерлі ісіктерге келетін болсақ, көбінесе FISH зерттеуі сүт безі, қуық, тоқ ішек, нейробластома, ретинобластома және т.б. қатерлі ісіктерді диагностикалауда қолданылады. FISH зерттеуін пренатальды және имплантацияға дейінгі диагностикада да қолдануға болады. FISH сынағы көбінесе молекулалық және цитогенетикалық диагностиканың басқа әдістерімен бірге жасалады. Бұл зерттеудің нәтижесі қосымша зертханалық және аспаптық мәліметтердің нәтижелерімен бірге бағаланады. Мүмкіндіктер мен көрсеткіштердің салыстырмалы артықшылығына қарамастан, FISH әдісінің кемшілігі -бұл арнайылылық пен ерекшелік, өйткені ол арқылы "алынатын" ақпарат тиісті зонд жауап беретін (будандастырылған) аймақпен шектеледі. Сондықтан, кейде оны қолданар алдында геномның белгілі бір аймағында ауытқудың бар-жоғын басқа әдіспен анықтау пайдалы (мысалы, хромосомалық икроматрицалық анализ- ХМА), содан кейін зерттелетін күрделі хромосомалық қайта құрудың құрылымын нақтылау үшін FISH қолданылады. Хромосомалық микроматрицалық анализ (Chromosomal microarray analysis - array-CGH - массивке негізделген салыстырмалы геномдық будандастыру) басқа цитогенетикалық әдістер хромосомалар санының немесе құрылымының елеулі өзгерістерін ғана анықтаса, ХМА (aCGH) ДНҚ деңгейіне түсіп, ондағы субмикроскопиялық өзгерістерді көруге мүмкіндік береді. Бұл қуатты диагностикалық құрал бүкіл геномды талдауға қолданады; содан кейін көптеп алынған фрагменттер кремнийдің немесе әйнектің қатты матрицасына (микрочиптің өзі) бекітілген белгілермен немесе зондтармен будандастырылады. Мұндай ерекше байланыстыру геномның көптеген функционалды маңызды аймақтарын көруге және оларға әсер ететін бірнеше жүзге дейін өзгерістерді анықтауға мүмкіндік береді — осылайша бұл әдіс әдеттегі цитогенетика мен FISH әдісімен салыстырғанда жоғарғы мүмкіндікке ие. Бұл талдау хромосомалардың барлық аймақтарын зерттейді және генетикалық материалдың артық немесе жетіспейтіндігін анықтайды: сандық ауытқулар, дупликациялар және делециялар. Талдау геномдағы клиникалық маңыздылығы бар барлық кішігірім құрылымдық бұзылуларды сонымен қатар, бұрын патогендік өзгерістер сипатталмаған басқа геномдық учаскелер арасындағы өзгерістерді де анықтауға мүмкіндік береді. Бұл барлық белгілі микроделециялық синдромдарды және кейбір моногендік аурулармен байланысты синдромдарды диагностикалауға (гендер делецияланған жағдайда), сонымен қатар бұрын сипатталмаған немесе өте сирек кездесетін хромосома құрылымындағы өзгерістерді анықтауға мүмкіндік береді. Лигирленген олигонуклеотидті зондтарды қолдана отырып мультиплексті амплификация әдісі (MLPA-Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) - әр түрлі ұзындықтағы олигонуклеотидті праймерлерді (ДНҚ репликациясының бастапқы нүктесі ретінде қызмет ететін нуклеин қышқылының фрагменттерін) зерттелетін ДНҚ-мен будандастыруға негізделген, содан кейін байланыстыру (лат. ligare - "байланыстыру", жаңа химиялық байланыс түзу үшін екі молекуланың қосылуы), ПТР жүргізу және арнайы құралмен зерттелетін және бақылау үлгілерінің ұзындығын салыстырмалы талдау. Әдістеме ДНҚ лигазасының екі жұп комплементарлы олигонуклеотидтерді in vitro зерттелетін ДНҚ тізбегімен байланыстыру қабілетін пайдаланады. Реакцияның ерекшелігі екі олигонуклеотидтің қосылыс аймағындағы гомологияның кез-келген бұзылуы олардың байланысын бірден болдырмайтындығымен қамтамасыз етіледі. Әдіс ДНҚ зондтарының құрылымына байланысты және негізінен жиі анеуплоидияларды анықтау үшін және сирек микроделециялық патологияларды анықтау үшін қолданылады. MLPA-аурумен байланысты гендік көшірме санының (CNV) өзгеруін зерттеудің озық әдісі. MLPA толық хромосомалардан бастап жеке экзондарға дейінгі барлық көшірме санының өзгеруін анықтау үшін пайдаланылуы мүмкін, сонымен қатар ДНҚ метилденуінің (MS-MLPA) өзгерістерін анықтау үшін пайдаланылады және патогендік гендердегі аберрацияларды өте ұқсас псевдогендерден ажырату үшін жеткілікті сезімталдыққа ие. Онкогеномикада MLPA ісік профилін оңтайландыру мақсатында соматикалық CNV зерттеу үшін қолданылады. жүктеу/скачать 195,5 Kb. Достарыңызбен бөлісу:
|