2015 ж., желтоқсан №4 №4, декабрь 2015 г

ВЕТЕРИНАРИЯ
 
 
 
20 
- 
отбор  и  подготовка  проб  для  анализа 
(осуществляется  работниками  хозяйства,  пре
-
доставляющего образцы;
 
- 
выделение  ДНК  из  исследуемых  образ
-
цов. 
 
Геномную  ДНК  выделяли  из  крови  коров, 
используя набор 
DiatomTMPrep
200 (Лаборатория 
Изоген,  Москва),  согласно  инструкции  фирмы 
изготовителя  и  «
Pure  Link  Genomic  DNA  Kits
»
, 
также  согласно  инструкции  прилагаемой  к 
набору.
 
Для  диагностикина  носительство  мутаций 
BLAD  и  CVM  с
 
помощью 
Real-Time  PCR  SNPs 
использовали  набор  TaqMan®  MGB  probes, 
FAM™  and  VIC®  dye
-
labeled,  предоставленной 
комапанией Applied Biosystems. В состав данного 
набора  входят  следующие  компоненты:  Taq
-
Man®  Universal  PCR  Master  Mix,  No  AmpErase® 
UNG (2X), 40X 
Assay Mix.  Нами,для проведения
 
Real-
Time PCR диагностики заказаны у компании 
Applied Biosystems следующие компонеты: прай
-
мер  для  секвенирования    Sequence  Detection 
Primer 80.0 nmol, фермент  Taq DNA Polymerase 
Recombinant 500 U, набор для генотипирования
, 
TaqMan  Genotyping  Master  Mix, 
Mini  Pack,  прай
-
меры  для  Реал  Тайм  ПЦР  диагностики  CVM, 
(CUSTTQMN 
SNP 
ASSAYS 
NON-HUMAN), 
праймеры  для  Реал
-
Тайм  ПЦР  диагностики 
BLAD, (CUST TQMN SNP ASSAYS NON-HUMAN).  
Как  показывает  анализ  литературы, 
Real-
Time PCR SNP 
диагностики часто используется в 
медицине  для  выявления  точечной  диагностики 
генетических  дефектов.  Детекция  точечной  му
-
тации методом Real
-Time  PCR  SNPs  (single  nuc-
leo
tide  polymorphisms  SNPs)  у  крупного  рогатого 
скота. 
 
Согласно  общепринятому  определению 
S
NPs  (от  англ.  Single  Nucleotide  Polymorphism) 
- 
это однонуклеотидные позиции в геномной ДНК, 
для  которых  в  популяции  имеются  различные 
варианты  последовательностей  (аллели)  с  час
-
тотой  редкого  аллеля  не  менее  1%.  Основным 
достоинством  SNPs  является  возможность 
использования  автоматических  методов  их 
детекции, например, Real 
-Time  PCR SNPs. 
Для  выявления  точечной  мутации,  BLAD, 
при  скринировании  известных  SNP,  в  каждом 
случае  нужны  только  те  олигонуклеотиды,  ко
-
торые  соответствуют  известным  аллельным 
вариантам.  Такие  аллель
-
специфические  набо
-
ры  олигонуклеотиды  будут  использоваться  для 
кодирующей части гена СД18 у крупного рогатого 
скота в положениях 383 A/G, для Real 
-Time PCR 
SNPs  диагностики  CVM  точечная  G/T  мутация 
гена SLC35A3 в позиции 559, при дефиците ури
-
диномонофосфатсинтетазы  точечная  мутация 
локалозивана  С/Т  в  кодоне  405  экзона  5 
(таблица 1).  
 
Real-
Time PCR  SNPs диагностика скрытых 
генетических дефектов, BLAD, CVM проводилась 
на  приборе  Американского  производства  Quant 
Studio 5 Real-Time PCR System. 
 
Таблица 1 
- 
Генетические дефекты у крупного рогатого скота и их характеристика
 
 
Основные параметры
 
Название генетического дефекта
 
BLAD 
CVM 
Название гена
 
CD 18 
SLC35A3 
Локализация гена
 
Хромосома 1
 
Хромосома 3
 
Размер гена
 
37 901 п.н.
 
58582 п.н.
 
Замена
 
нуклеотида
 
wild type/mutant type 
в позиции 383 A 
-  G 
в позиции 559 G 
- T 
Здоровые гомозиготные
 
A/A 
G/ G 
Гетерозиготные носители
 
A/G 
G/T 
Гомозиготные носители
 
G/G 
T /T 
   
 
 
В первую очередь, перед выделением ДНК 
прогревали  лизирующий  раствор
 
и  раствор  для 
отмывки из набора «
Pure Link Genomic DNA Kits
» 
в  течение  1  часа  при  температуре  65°С.  Затем, 
внесли  в  пробирку  100  мкл  подготовленную  с 
меркаптоэтанолом  смесь  и  тщательно  переме
-
шивали  на  вортексе  и  прогревали  5  минут  при 
температуре  65  °С.  Центрфугировали  5  секунд 
при  5000 об/мин на микроцентрифуге. В каждую 
пробирку, затем вносили 25 мкл  универсального 
ресуспендированного сорбента из набора. Пере
-
мешивали  на  вортексе,  ставили  на  штатив  на  2 
минуты, затем повторяли эту процедуру еще раз 
и ставили на штатив на 5 минут. Осаждали сор
-
бент центрифугированием при 5000 об/мин в те
-
чение  30  секунд.  Удаляли  надосадочную  жид
-
кость,  затем  вносили  по  300  мкл  раствора  для 
отмывки.
 
Перемешивали на вортексе, осаждали сор
-
бент  центрифугированием,  удаляли  надосадоч
-
ную жидкость. Вносили 500 мкл раствора для от
-
мывки,  перемешивали  на  вортексе,  центри
-
фугировали,  удаляли  надосадочную  жидкость. 
Повторяли  процедуру  отмывки  с  использова
-
нием  раствора  для  отмывки.  Подсушивали  сор
-
бент универсальный после удаления надосадоч
-
ной жидкости в термостате при 65°С в течение 5
-
10  минут.  В  пробирки  вносили  по  50  мкл  ТЕ
-
буфера  для  элюции  ДНК.  Перемешивали  на 
вортексе, инкубировали в термостате при 65°С в 
течение  5  минут  с  периодическим  встряхива
-
нием.  Центрифугировали
 
пробирки  на  макси
-
мальных оборотах микроцентрифуги в течение 1 

ВЕТЕРИНАРИЯ
 
 
 
21 
минуты.  Надосадочная  жидкость  содержит  очи
-
щенную ДНК, которую в последующем использо
-
вали для полимеразной цепной реакции. Концен
-
трацию полученной ДНК проверяли на 
Qubit
® 3.0 
Fluorometer.  
Приготовление  праймеров  рабочей  кон
-
центрации.  Праймеры  для  проведения  ПЦР  бы
-
ли  синтезированы  Американской  компанией 
Ap-
plied Biosystems 
и были предоставлены в
 
лиофи
-
лизированной  форме  в  количестве 
80  nmol. 
В 
пробирку  Эппендорфа,  где  находится  синтези
-
рованные праймеры в количестве 
80  nmo  l
доба
-
вили 
 
800 мкл ТЕ буфера, после  встряхнули не
-
сколько  секунд  для  растворения  праймера.  За
-
тем приготовили аликвоты объемом 50 мкл, 
 
од
-
ну из них разбавили ТЕ  буфером  в четыре  раза 
(т.е к  50 мкл добавили  150 мкл ТЕ буфера).  Ра
-
бочая  концентрация  праймеров  составила  25 
мкМ.  Аликвоты  праймеров,
 
концентрацией  100 
мкМ  рекомендуется    хранить  при 
-20
0
С.  Хране
-
ние готовых праймеров рабочей конценрации до
-
пускается  при  температуре  +4
0
С
 
в  течение 
месяца.  
 
Приготовление  dNTP  смеси  для  амплифи
-
кации.Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты 
A,G,C 
и 
T
были приобретены в компании Thermo Scien
-
tific в виде 100 мМ раствора в количестве 1,0 мл. 
Первую  очередь  перемешиваем  все  четыре 
dNTP  и  получается    концентрация  каждого 
праймера
 
25 мМ. Затем нужно сделать аликвоты 
по  50  мкл  25  мМ  dNTP  и  хранить  их  в  замо
-
роженном  виде.  Для  амплификации  нужного 
фрагмента  ДНК  по  изучаемым  локусам 
 
исполь
-
зовали  амплификатор  производства  Германии 
Эппендорф. 
 
В  нашей  работе  для  Real
-Time  PCR  SNPs 
диагностики  точечной  мутации  CVM  мы  исполь
-
зовали праймеры для Реал
-
Тайм ПЦР, имеющие 
следующую  последовательность:  F–
5'
–
AGCT-
GGCACAATTTGTAGGT  -
3'  и  R 
-5'-CTCAAA-
GTAAACCCCAGCAAAGC-
3' и меченые F  –
  VIC  - 
5'-  TCATGGCAGTTCTCA 
–
 
3'  и  R  –
  FAM  -  5'-
TCATGGCATTTCTCA-3'. 
Для Real
-
Time PCR  SNPs диагностики то
-
чечной  мутации    BLAD  использовали  праймеры 
для  Реал
-
Тайм  ПЦР,  имеющие  следующую 
последовательность:  F–
5'
–
CAGTTGCGTTCAAT-
GTGACCTT  -3'  R-5'-GAGTAGGAGAGGTCCAT-
CAGGTA-
3' и меченые F –
 VIC - 5'-CCCCATCGA-
CCTGTAC 
–
 
3' и R –
 FAM - 5'-  CCCATCGGCCT-
GTAC-3'. 
Праймеры  для  генотипирования  и  мече
-
ные  зонды  VIC,  FAM  праймеры  были    синтези
-
рованы –
 
компанией Applied Biosystems (США). В 
первую  очередь  нормализовали  концентрацию 
образцов  ДНК  путем  разбавления  ТЕ  буфером 
до конечной концентрации 20
-
40 нг/мкл. 
 
Компоненты Real
-Time PCR:  
1. TaqMan Genotyping  Master Mix (40 × на
-
бор для генотипирования) –
 
12,5 мкл 
 
2.  Прямые  и  обратные  праймеры 
-  0,625 
мкл 
 
3. ДНК –
 
1,0 мкл 
 
4. H
2
O - 
бидистиллированаая –
 
10,8 мкл.
 
Real-Time 
PCR  диагностику  BLAD  прово
-
дили с помощью амплификатора Real Time Step
-
OnePlus,  объемом  реакционной  смеси  50  мкл. 
Условия проведения ПЦР покзаны на рисунке 1. 
В  пробирку  Эппендорфа  набираем  компонеты 
реакционной  смеси,  имеющий  состав:  TaqMan 
Genotyping  Mas
ter  Mix,  праймеры  и  бидистил
-
лированная  вода.  Затем  смесь  перемешиваем 
на  вортексе  и  переносим  реакционную  смесь  в 
стрипы и добавляем ДНК с концентрацией 20
-40 
нг/мкл. Во избежание загрязнения стрипов рабо
-
таем в латексной перчатке. 
 
          
Аллельное  распознавание  может 
осуществляться  путем  анализа  графиков  амп
-
лификации в режиме реального времени. Теоре
-
тически,  зонды  VIC  типа  будут  комплементарны
 
только  дикому  типу  и  формируют  стандартный 
график  амплификации,  в  то  время  как  FAM 
зонды комплементарны
 
только мутантным алле
-
лям  и  формируют  собой  график  амплификации
. 
Таким образом, генотип может быть точно опре
-
делен  посредством  сравнения  графиков  уси
-
ления (Рисунок 2
). 
В  то  время
, 
как  графики  амплификации  в 
режиме  реального  времени  исследовались  на 
наличие BLAD, слабый неспецифический сигнал 
наблюдался  в  аллели 
wild-type 
(Рисунок  3). 
Данный эффект также был
 
выявлен в результате 
проведения  и  предыдущих  исследований.  Веро
-
ятно,  это происходит в связи с тем,  что  аллель
-
специфический  зонд  имеет  одно  ошибочное 
связывание пары оснований с другой аллелью; а 
также,  если  нуклеотидная  последовательность 
рядом  с  участком  SNP,  сильно  насыщенным 
АТ/GC  или  содержащим  определенные  соче
-
тания  последовательности,  а  зонд,  как  правило, 
менее  отличителен  по  сравнению  с  несоответ
-
ствующей  аллелей.  Тем  не  менее,  образец  гра
-
фиков  амплификации  в  режиме  реального  вре
-
мени  можно  легко  разграничить  на 
wild-type 
и 
mutant-
type,  потому  что  интенсивность  неспеци
-
фического сигнала намного ниже по сравнению с 
отметкой цели.
 
На рисунке
 
2 начиная с  20
-
22 цикла  по  32 
наблюдается  тенденция  увеличения  сигнала  в 
результате  накопления  продуктов  амплифика
-
ции,  у  гетеризиготных  животных  обе  кривые 
почти  параллельные.  Как  видно  из  рисунка  1  у 
гомозиготных  здоровых  животных  на  дисплее 
появляются  две  кривые,  но  продукты  амплифи
-
кации  с  VIC  и  FAM  накапливаются  с  разной  ин
-
тенсивностью.  Так,  более  интенсивно  накапли
-
вается продукт с  VIC зондом (с 
wild-type 
аллели 
гена  CD  18),  если  животное  является  гетерози
-
готным  носителем  получаем  изображение  с 
параллельными кривыми. 
 
 

ВЕТЕРИНАРИЯ____22___Рисунок_1_-_Графическое_изображение_проведения_Real_-time_PCR_SNPs'>ВЕТЕРИНАРИЯ
 
 
 
22 
 
 
Рисунок 1 
- 
Графическое изображение проведения Real
-time PCR SNPs  
диагностики точечной мутации
 
 
 
 
Рисунок 2 
- 
Графическое изображение результатов Real
-
time PCR SNPs диагностики 
точечной мутации гена CD 18 (BLAD), (амплификация с FAM зондом, mutant PCR primers, 
 
и с VIC зондом, wild
-type primers) 
 
Real-
Time  PCR  диагностику  CVM  прово
-
дили  с  помощью  амплификатора 
QuantStudio  5 
Real-TimePCRSystem
,  объемом  реакционной 
смеси 50  мкл. Условия проведения ПЦР показа
-
ны  на  рисунке  4
. 
В  пробирку  Эппендорфа  наби
-
рается 
компоненты 
реакционной 
смеси, 
имеющий состав: TaqMan Genotyping Master Mix, 
праймеры  и  бидистиллированная  вода.  Затем 
смесь  перемешивается  на  вортексе  и  реак
-
ционная  смесь  переносится  в  стрипы  и  добав
-
ляется  ДНК.  Во  избежание  загрязнения  стрипов 
работа  производится  в  латексной  перчатке  и  с 
помощью  держателя  герметично  закрываем 
крышку стрипа.
 
Необходимо  отметить,  что  использование 
метода  ПЦР
-
ПДРФ  анализа  для  детекции  носи
-
телей  генетического  дефекта  CVM  является
 
сложным  и  трудоемким  способом,  так  как  нет 

ВЕТЕРИНАРИЯ
 
 
 
23 
соответствующей  рестриктазы  для  выявления 
точечной  мутации.  Обычно  для  детекции  носи
-
телей  CVM  используются  различные  варианты 
метода  полимеразной  цепной  реакции:  ампли
-
фикация  участка  гена  с  помощью  аллельспеци
-
фических  праймеров  (AS
-
PCR),  создание  сайта 
рестрикции  при  амплификации  для  выявления 
точечной  мутации  (CRS
-PCR  -created  restriction 
site) и введение в последовательности праймера 
замену  одного  нуклеотида  с  целью  создания 
сайта рестрикции для эндонуклеазы (PCR
-PIRA). 
Поэтому, нами был выбран метод Real
-time PCR 
SNPs  диагностики  для  детекции  носителей 
генетического  дефекта  CVM.  Метод  Real
-time 
PCR SNPs диагностики позволяет в течение двух 
часов  точно  определить  здоровых  гомозиготных 
животных  и  гетерозиготных  носителей  мутации 
(рисунок  4,  5).  У  гетерозиготных  носителей  му
-
тации  идет  амплификация  с  двумя  зондами  VIC 
и FAM и соответственно образуются две кривые.
 
 
 
 
Рисунок 3 
- 
Результаты Real
-
time PCR диагностики, гомозиготное здоровое 
 
животное по локусу B
LAD 
 
 
 
Рисунок 4 
- 
Результаты Real
-
time PCR диагностики, гомозиготное здоровое животное по 

ВЕТЕРИНАРИЯ
 
 
 
24 
локусу CVM (амплификация с VIC зондом, 
wild-type) 
 
 
Рисунок 5 
-  
Графическое изображение результатов 
Real-time PCR SNPs 
диагностики 
точечной мутации и гена 
SLC35A3
, гетерозиготный носитель 
CVM 
(амплификация с 
FAM 
зондом, 
mutant-type 
и с 
VIC 
зондом, 

жүктеу/скачать 6,12 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: