Кенжебаева Сəуле Сағындыққызы биотехнологиядағЫ Қазіргі əдістер
Тризол реагентін пайдаланып
жүктеу/скачать 5,04 Mb. Pdf көрінісі
|
- Бұл бет үшін навигация:
- 3.9. Жоғары тұзды ерітіндіні қолдану арқылы өсімдіктен жаппай РНҚ-ны бөліп алу
| 3.8. Тризол реагентін пайдаланып,
өсімдіктен жаппай РНҚ-ны бөлу Жалпы мағлұматтар. РНҚ дəрі-дəрмектерді гендер, сонымен қатар трансгенді өсімдіктердің транскрипциясын жəне кДНҚ кiтапханасын зерттеу үшін қажет. РНҚ бөлудегі негізгі қиындық РНҚ-аз-ның жоғары белсенділігімен байланысты, клетка лизисінің нəтижесінде РНҚ-ның жедел деградациясына əкеледі. РНҚ-азалар ДНҚ-азамен салыстырғанда тұрақты, қыздырғанда белсенді түрде қалады. Көптеген əдістердің негізінде РНҚ-азды белсенді емес түріне ауыстыру жəне оңай түзілетін РНҚ-белок кешендерін бұзу құрайды. Өсімдіктерден РНҚ-ны бөліп алу үшін қолданылатын ерітінділердің құрамында фенол болады, оның қатысуымен рибонуклеазды белок ингибирленеді жəне белоктар дена- турацияланады. Ұсынылып отырған тəсіл РНҚ бөлу үшін құрамында фенолы бар тризол реагентін қолдануға негізделген. Жұмыс жасау барысы: Өсімдік материалын микропробиркаға ауыстырады жəне келсаптың көмегімен 1 мл тризолда гомогениза- циялайды. Су моншасында 65ºС 10 мин көлемінде инкубациялайды. Инкубациялау барысында пробирканы қарқынды түрде араластырып тұрады. Термошайқағышта жақсы инкубацияланады. 200 мкл хлоро- форм қосып, 5 мин бойы бірқалыпты араластырып тұрады. 12000 ай- налымда (g) 15 мин центрифугалайды. Сулы фазада жаңа түтiкке ауы- стырады жəне 1/10 бөлік мөлшерде 3 М ацетат натрий (рН 5,2) қосады. Араластырады жəне тең көлемде салқын изопропанол қосады. Қайта араластырады жəне -20ºС-та 15-30 мин барысында инкубациялайды. Бес минут көлемінде 6000 айналымда (g) центрифугалайды. Тұнбаны бірнеше рет 70% этанолмен шаяды, кептіреді жəне құрамы 10 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА немесе дистилденген су ТЕ буфермен ерітеді. Бөлінген жаппай РНҚ құрамында 2-4% м РНҚ болады, қалған бөлігін рРНҚ жəне тРНҚ құрайды. 3.9. Жоғары тұзды ерітіндіні қолдану арқылы өсімдіктен жаппай РНҚ-ны бөліп алу Жалпы мағлұматтар. Жаппай РНҚ-ны бөліп алудың басқа қарапайым жəне тез əдісі жоғары тұзды ерітіндіні қолдануға негізделген, олар РНҚ-аздың рибонуклеазды белсенділігін тежейді жəне денатурланған белоктардың тұнуына əсер етеді. 123 Жұмыс жасау барысы: 1 г өсімдік материалын (көбіне жапырақтарды) құрамы 1 М NaCl,, 25 мМ MgCl, 0,5 М ацетат натрий, 20% этанолда 3% SDS бар, (рН 6,0). 5-7 мл буферде гомогенизация- лайды. 37ºС 30 мин бойы инкубациялайды. Инкубациялау уақытында түтiктi бірнеше рет араластырады. Тең көлемдегі хлороформ қосып жəне бес минут көлемінде араластырады. 15 мин 400 айналымда (g) центрифугалайды. Құрамында РНҚ бар сулы фазаны жаңа түтiкке ау- ыстырады жəне 1/10 бөлік мөлшерде 3 М ацетат натрий (рН 5,2) қосады. Араластырады жəне тең көлемде салқын изопропанол қосады. Қайта араластырады жəне -20ºС 15-30 мин барысында инкубациялайды. Бес мин көлемінде 6000 айналымда (g) центрифугалайды. Тұнбаны бірнеше рет 70 % этанолмен шаяды, кептіреді жəне құрамы 10 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА, немесе дистилденген су ТЕ буфермен ерітеді. Бұл қарапайым тəсіл өсімдіктердің вирустармен, вириодтармен зақымданғанын тексе- ру қажет. жүктеу/скачать 5,04 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|