Клинические дисциплины chapter clinical disciplines акушерство и гинекология obstetrics and gynecology
жүктеу/скачать 19,82 Mb. Pdf көрінісі
|
- Бұл бет үшін навигация:
- Ключевые слова
- D.A. ABDAMBAYEV, M.T. OMYRZAKOV, A.S.KOZHAMZHAROVA, U.M. DATKHAEV., T.B. BAIZOLDANOV
- Keywords
- ПОЛИМОРФИЗМ ДНК И НАКОПЛЕНИЕ КАННАБИНОИДОВ У КУЛЬТУРНОЙ И ДИКОРАСТУЩЕЙ КОНОПЛИ В ШУЙСКОЙ ДОЛИНЕ
- Результаты и их обсуждение.
Д.А. АБДАМБАЕВ, М.Т. ОМЫРЗАКОВ, А.С. КОЖАМЖАРОВА, У.М. ДАТХАЕВ, Т.Б. БАЙЗОЛДАНОВ Казахский национальный медицинский университет им. С.Д. Асфендиярова Модуль «Фармацевт-технолог» ОСОБЕННОСТИ СИНТЕЗА И БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ПРОИЗВОДНЫХ АЦЕТИЛЕНА Резюме: В области органической химииацетиленовые производные занимают одно из лидирующих положений в качестве основных реагентов для производства важных биологически активных веществ и продуктов хозяйственной промышленности. Специфические особенности химического поведения и биологическая активность производных ацетиленов вызваны высоко энергичной тройной связью и мобильным этинильным водородом. Это объясняет легкость, с которой ацетиленовые соединения вступают во многие реакции. В связи с этим в данной статье приводится обзор особенности синтеза и биологической активности производных ацетилена. Ключевые слова: Ацетилен, третичная связь,пропаргил, биологическая активность.
543
Asfendiyarov Kazakh National Medical University Module of«Pharmacist-technologist» FEATURES OF SYNTHESIS AND BIOLOGICAL ACTIVITY OF ACETYLENE DERIVATIVES Resume: In the field of organic chemistry, acetylene derivatives have a leading position as the main reagent for the production of important biologically active substances and products of agriculture industry. Specific features of the chemical behaviorand biological activity of acetylene derivatives caused by highly energetic triple bond and mobile ethynyl hydrogen. This explains that the acetylenic compounds easilyundergo to many reactions: joining the triple bond (electrophilic, nucleophilic, radical), complexation, hydrogen substitution, etc. In this regard, this article provides an overview of features of the synthesis and biological activity of acetylene derivatives.
УДК: 581.5;581.19; 577.15;633.88
ЕНУ им. Л.Н.Гумилёва, ТарГУ им. М.Х.Дулати, КазНМУ им. С.Д.Асфендиярова
В природе больше половины видов растений являются перекрёстноопыляемыми. Такое
размножение обусловливает непрерывную рекомбинацию генов. Динамика популяции выражается в изменении частот встречаемости каждого
аллеля данного
гена. Для
определения популяционной структуры проводят анализ по различным генетическим маркерам [1]. С помощью нескольких десятков биохимических маркеров выявлен генетический полиморфизм у более чем 200 видов живых организмов и разработаны основные теоретические положения популяционной генетики (1, 43). Однако использованные маркёры
опосредовано определяют генетические различия между таксонами. Например, анализ белков позволяет исследовать полиморфизм только белок- кодирующих последовательностей и только
у экспрессирующихся генов. Открытие метода полимеразной цепной реакции (ПЦР, Polymerase chain reaction, PCR) стало одним из наиболее выдающихся событий в области молекулярной биологии за последние 20 лет. Использование молекулярных ДНК- маркеров [2] позволило идентифицировать гены и выявить генетический полиморфизм различных организмов [3] непосредственно на уровне генов, а не на уровне их продуктов. Одним из 4 модификаций ПЦР является RAPD- метод, преимуществом, которого является простота и скорость проведения анализа [4-6]. В Казахстане, где дикорастущая наркотическая конопля только в Шуйской долине
занимает площадь
более 1,2
млн.га, ненаркотическая произрастает в половине областей особую актуальность приобретают исследование по
популяционному полиморфизму. Это связано
с необходимостью как использования её в промышленном производстве, так и разработке методов уничтожения. Исходя из этого, целью нашей работы было изучение полиморфизма популяций и влияния перекрёстного опыления культурной конопли
(Cannabis sativa)
дикорастущей (Cannabis ruderalis) на генетический полиморфизм потомства Материалы и методы. Объектом исследования являлись сорт Fedora 17 и его расщепляющееся в Шуйской долине гибридное потомство F 1 и F 2 , а также дикие популяции конопли, произраставшие на территории Меркенского района Жамбылской области и Уйгурского района Алматинской области. Для анализа брали созревшие и отлежавшиеся более 30 дней семена и выделяли ДНК цетилтриметил аммониум бромидом (СТАВ) с 20 мМ 2-меркаптоэтанолом по общепринятой методике [7]. Чистоту полученных препаратов ДНК проверяли электрофоретическим разделением в агарозном геле. Для PCR-амплификации использовали девять праймеров. 3.CCGAATTCGC, 4.CTGACCAGCC, 5. ATCTGGTGGT, 6. GGACCCCGCC, 7.TCAGGACGCTAC, C, 12CCTTGACGCA,14. AGCAGCGTCG, 15GTGTGCCCCA, 16.GGGGTGACGA . Шесть из них были наиболее специфичными. Реакционная смесь объемом 20 мкл содержала 50 мМ KCl, 20 мМ трис-HCl, рН 8,4, 3 мМ MgCl 2 , 0,01% Tween-20, 0,15 мМ каждого dNTP, 0,2 мкМ праймера, 20 нг ДНК и 1 ед. Tag-полимеразы. В пробирки наслаивали 40 мкл минерального масла. PCR- амплификацию проводили в следующем режиме: первые четыре цикла – 1 мин. При 93 0 С, 1,5 мин. При 43 0 С и 2 мин. При 72 0
0 С (всего 35 циклов). Последняя элонгация длилась 10 мин. Продукты амплификации разделяли электрофорезом в 10¿ ПААГ и гели просматривали в GelDoc при длине волны от 260 до 360 нм. Для
определения генетической дистанции по
полиморфизму RAPD-спектров и получения матрицы состояния бинарных признаков были использованы алгоритмы Нея и Ли [8]. По матрице состояния были построены дендрограммы генетических дистанции с помощью невзвешенного парногруппового метода с арифметическим усреднением – UPGMA (unweighted pair- group mathematical averige). Определение содержания каннабиноидов проводили на газожидкостном хроматографе-масс-спектрографе GCMS фирмы “Shimadzu”. Листья для анализа брали на X-XI (фаза молочной – молочно-восковой спелости) и XI-XII (фаза молочно-восковой – восковой спелости) этапах
органогенеза. Размельченные листья обычно
экстрагировали этанолом или метанолом (100 мг образца доводим
до 10
мл, для
конечной концентрации
544 каннабиноидов 1мг/мл) в течение 1 часа при 70 0 С или 24 часа при комнатной температуре. Затем надосадочную жидкость декантировали и использовали для нанесения в плазменно-ионизационный детектор (1мкл).
праймеры обеспечили синтез
специфических и воспроизводимых наборов ампликонов. Выявлен полиморфизм исследуемых образцов. Все шесть
исследованных образцов конопли имели специфические RAPD-спектры, которые отличались числом, размерами ампликонов (от 90 до 1700 п.н.) и степенью их выраженности на электрофореграмме. Общее число
ампликонов в зависимости от праймера колеблется от 56 до 95.
Электрофоретические спектры
(рис.1 - 4) свидетельствуют о том, что наряду с общими ампликонами, характерными для всех образцов, существуют специфичные фрагменты ДНК. На рис.1 приведён RAPD-спектр 6 образцов, полученный при использовании праймеров 3 и 12. С помощью праймера 3 амплифицирован всего 71 фрагмент. Из них 6 являются общими для всех образцов и имеют размер от 170 до 800 н.п. С помощью данного праймера выявлен полиморфизм ДНК у анализируемых образцов конопли: у образца 3 (потомство F 2 сорта Fedora 17) обнаружены специфичные фрагменты длинной 340 и более 1700 н.п., но отсутствуют 4 фрагмента ДНК, длинной около 350, 500, 580 и 1600 н.п., присутствующие у всех остальных образцов. По степени выраженности спектра образец 3 отличается четкими зонами с ампликонами длинной около 110, 240, 250, 610 и 670 п.н. Они присутствуют или отсутствуют в спектре у других образцов. Менее выражена у него зона в 460 н.п., которая у всех остальных является четкой. Дикорастущие популяции из Меркенского – образцы 4 и 6 и Уйгурского (образец 5) районов также отличаются друг от друга по составу ампликонов. Так образец 5 имеет в спектре фрагменты размерм 280 и 610 п.н., отсутствующие у образцов из шуйских популяции, но присутствующие в спектре культурного сорта и его потомства F 2 . Сходство между уйгурской популяцией и культурным сортом заключается в наличии в спектре фрагмента ДНК в 1050 н.п., который отсутствует у остальных образцов. У дикорастущих популяций в спектре отсутствует ампликон размером 330 н.п., который обычно проявляется у сорта и его F 2 потомства. В RAPD-спектре праймера 12 выявлено 10 общих для всех образцов ампликонов размером от 170 до 1000 н.п. Для образца 3 характерно наличие 710, 520, 340 и 240 н.п. фрагментов, отсутствующих у других образцов. Фрагменты длиной около 280, 470, 1100 и 1310 н.п. у него выражены более
чётко, чем
у исходного сорта. Популяции дикорастущей конопли отличаются между собой в основном лишь по степени выраженности тех или иных фрагментов ДНК в спектре. У них отсутствует фрагмент размером 320 н.п.,
обычный для
культурного сорта
и его
расщепляющегося в F 1 и F 2 потомства. Фрагмент размером 1600 н.п. не проявляется в спектре ДНК конопли из Меркенского района с зелёными листьями, в то время как у этой же популяции, но с фиолетовыми листьями, у уйгурской популяции и потомства F 1 исходного сорта он присутствует.
1 2 3 4 5 6 M 1 2 3 4 5 6
500
400 300
200
100
Olig 3 Olig 12
Рисунок 1 - Электрофоретические спектры продуктов RAPD-амплификации ДНК с праймерами 3 и 12 сорта Fedora 17 (1), его расщепляющегося потомства F 1 (2) и F 2 (3) и диких популяций конопли Меркенского (4 – фиолетовые; 6 – зелёные листья) и Уйгурского (5) районов
С помощью праймера 4 (рис. 2) амплифицировано два фрагмента ДНК длиной около 90 и 260 н.п., которые являются общими для всех образцов. У сорта Fedora 17 (образец 1) с помощью этого праймера амплифицирован фрагмент ДНК в 1600 н.п., отсутствующий у других образцов. У 3 образца в спектре не отсутствует фрагмент в
545
720 н.п., присутствующий у других и обнаружен специфичный только для этого образца ампликон в 420 н.п. Специфичный фрагмент в 1500 н.п. выявлен у образца 2. Только у 5 образца в спектре проявляются специфичные фрагменты размером 370 и 460 н.п. В спектре у дикорастущих образцов также присутствуют специфичные фрагменты ДНК длиной 350 н.п., отсутствующие у сорта и его потомства. На рисунке 3 видно, что праймер 14 обуславливает амплификацию 95 фрагментов. 9 из них размером от 90 до 680 н.п. являются общими для всех образцов. В RAPD- спектре потомства F 2 исходного сорта обнаружены специфичные фрагменты размером 180, 270 и 900 н.п., которые не характерны для остальных образцов. Однако у этого образца отсутствуют 280, 320 и 360 н.п. фрагменты присутствующие в спектре у других образцов. Для меркенской конопли (4 и 6 образцы) и потомства F 1 сорта Fedora 17 характерно наличие фрагментов в 220 и 720 н.п. В спектре меркенского образца, фиолетовые листья и F 2 потомства исходного сорта выявлен специфичный фрагмент в 120 н.п.
1 2 3 4 5 6 М М 1 2 3 4 5 6
Рисунок 2 - Рисунок 3 - Электрофоретические Электрофоретические спектры спектры продуктов RAPD-амп продуктов RAPD-амплификации ДНК лификации ДНК с праймером 4. с праймером 14. Обозначения те же, что на рис.1 Обозначения те же, что на рис.1
Полиморфизм ДНК у анализируемых образцов конопли выявлен и при использовании праймеров 15 и 16 (рис.4). С помощью праймера 15 у 3-го образца амплифицированы фрагменты ДНК в 150 и 320 н.п., которые не синтезировались у других образцов. В ДНК-спектре образца из Меркенского района, зелёные листья (6-й образец) отсутствовал фрагмент в 370 н.п., характерный для двух других образцов дикой конопли (4, 5 образцы). При использовании же праймера 16 синтезировано 56 ампликонов. Фрагменты размером в 180 и 270 н.п. выявлены у всех образцов. У 3 образца обнаружены специфичные фрагменты длиной около 200 и 1400 н.п., а также отсутствует, имеющийся у других образцов, фрагмент в 700 н.п. Сходство диких популяции заключается в наличии у них в спектре фрагмента в 1000 н.п., который отсутствует у культурного сорта и его потомства F 1 и F 2.
100 200
300 400
100
200 300 400
546
Рисунок 4 - Электрофоретические спектры продуктов RAPD-амплификации ДНК с праймерами 15 и 16. Обозначения те же, что на рисунке 1
В целом, можно сказать, что присутствие в RAPD-спектре у сорта Fedora 17 отдельных фрагментов ДНК и отсутствие их у его потомства F 1 и F
2 свидетельствует о гетерогенности по данному локусу. Данные по полиморфизму электрофоретических спектров продуктов RAPD-амплификации ДНК позволили провести кластерный анализ различных образцов конопли с помощью программы UPGMA (рисунок5-8).
Рисунок 5 - Дендрограмма генетической взаимосвязи между различными образцами дикой и культурной конопли, рассчитанным по данным RAPD-анализа с праймером 3 методом UPGMA
Рисунок 6 - Дендрограмма генетической взаимосвязи между различными образцами дикой и культурной конопли, рассчитанным по данным RAPD-анализа с праймером 14 методом UPGMA
547
Рисунок 7 - Дендрограмма генетической взаимосвязи между различными образцами дикой и культурной конопли, рассчитанным по данным RAPD-анализа с праймером 15 методом UPGMA
Рисунок 8 - Дендрограмма генетической взаимосвязи между различными образцами дикой и культурной конопли, рассчитанным по данным RAPD-анализа с праймером 16 методом UPGMA
Из данных дендрограмм (рис. 5-8) видно, что шуйская популяция (6 образец) и потомство F 1 сорта Fedora 17 образуют отдельный кластер. Это может свидетельствовать об их генетическом сходстве. Наиболее близко к ним находится сам сорт Fedora 17, а также 4-й шуйский образец. Из дендрограммы, составленной на основе RAPD-анализа с праймером 15, видно, что дикие популяции из Меркенского и Уйгурского районов (4 и 5 образцы) образуют одну генетическую группу. Самым отдаленным по генетическому родству является потомство F 2 сорта Fedora 17. Таким образом, можно сказать, что генетическая близость шуйской конопли и потомства F 1 возможно является результатом перекрестного опыления исходного сорта пыльцой дикой конопли. В то время как наибольшая отдаленность потомства F 2 сорта Fedora 17 объясняется расщеплением его
гетерогенных (гетерозиготных) родителей. Наличие разницы в генетической дистанции между популяциями Cannabis ruderalis может быть обусловлено гетерогенной структурой данных популяций. Одним из маркёров популяций у конопли являются каннабиноиды. Одни из них не обладают наркотическим – КБН (каннабинол) и КБД (каннабидиол), а другие - ТГК (тетрагидроканнабинол), ТГКА обладают наркотическим эффектом. Мы попытались изучить наследование этого признака у потомства культурного сорта. В таблице приведены результаты определения содержания каннабиноидов у сорта Fedora 17, его потомства F 1 и F
2 , популяциях Cannabis ruderalis. Таблица 1 - Содержание каннабиноидов у европейского сорта, его потомства F 1 и популяций дикой конопли № Сорт/экотип Этап органогенеза ТГК, % КБД, % 1.
Fedora 17 F 1
X-XI 0,12
0,82 2.
F 2 Fedora 17 X-XI (Меркенский р-н) 0,18
1,08 3.
F 2
Fedora 17 XI-XII (Меркенский р-н) 0,07
1,43 4.
F 2
Fedora 17 XI-XII (растение внешне сходное с Cannabis ruderalis; Меркенский р-н) 0,06
1,01 5.
Cannabis ruderalis XI-XII (растение с фиолетовыми листьями, Меркенский р- н, переправа) 1,25
0,48 6.
Cannabis ruderalis XI-XII (растение с зелеными листьями, Меркенский р-н, переправа) 1,32
0,14 7.
Cannabis ruderalis XI-XII (Уйгурский р-н, 1 крупное растение) 1,5 1,0
8. Cannabis ruderalis XI-XII (Уйгурский р-н, среднее растение) 1,0
0,66
Из приведенных данных видно, что у потомства F 1 исходного сорта не
наблюдается накопления наркотического соединения - тетрагидроканнабинола (ТГК), хотя несколько возрастает содержание каннабидиола (КБД). У исходного сорта в условиях Европы содержание ТГК не превышало 0,15¿, а КБД находилось примерно на том же уровне. Т.е. накопление ТГК является генетически детерминированным признаком и экологические условия (Шуйская долина) не влияют на накопление наркотического вещества. У дикорастущих шуйских популяций его содержание в сентябре-октябре в прицветниках достигает 8¿, а КБД и КБН -0,12 – 2¿ [9]. Это, по нашему мнению, связано с гомозиготностью дикорастущих популяций по признаку накопления ТГК.
548 Таким образом, сорт культурной конопли Cannabis sativa, его расшепляющееся потомство F 1 и F
2 , дикорастущие популяции Cannabis ruderalis отличаются друг от друга по структуре ДНК и накоплению каннабиноидов (т.е. генетически неоднородны). Уровень накопления каннабиноидов у конопли, в частности содержание ТГК, по всей видимости, является генетически детерминированным признаком. Можно ожидать, что посевы волокнистых ненаркотических сортов будут изменять генетическую структуру шуйских
популяций в сторону низкого содержания ТГК. Различия в уровне накопления ТГК и КБД связаны с неодинаковой активностью их
синтаз. Аминокислотная последовательность изоферментов у ТГКА- синтазы, КБД-синтазы неодинакова, что и определяет их каталитические свойства.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1
Сарсенбаев К.Н., Беков А.А.-Х., Рахимбаев И.Р. Изоферменты в хемосистематике высших растений. Алматы: 1982, - 145 с. 2
Welsh J., McClelland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. Nucler Acids Res., - 1990, - №18. - Р.7213-7218 3
Гостимский С.А., Кокаева З.Г., Боброва В.К. Использование молекулярных маркеров для анализа генома растений// Генетика. 1994. Т. 35. №11. С. 1538-1549 4
С.476-480 5
Оганесян А.С., Кочнева Е.З., Рысков А.П. Маркирование видов и сортов картофеля с помощью метода RAPD PCR// Генетика. - 1996. №32. - С.448-451 6
межвидовых и межсортовых различий// Молекулярная биология. 1999. - Т.33. - №5. - С.893-897 7
Jhingan A.R. A novel technology for DNA isolation// Methods of Mol. Cell. Biol. 1992. - №3. - P.15-22 8
Nei M., Li W. Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases// Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1979. - №76. - P.5269-5273 9
каннабиноидов.// Вестник КазНУ им.Аль-Фараби, сер.биол., - №1(22), - 18 – 20, - 2004. – 235 с.
жүктеу/скачать 19,82 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|