1-15 дәрістер. Микроскопиялық техниканың негіздері Дәріс Тақырыбы
жүктеу/скачать 152,73 Kb.
|
- Бұл бет үшін навигация:
- Қатырғыш микротомда кесу.
| 12 дәріс. Тақырыбы: Целлоидинді кесінділерді дайындау .
Дәрістің мақсаты: Целлоидинді кесінділерді дайындауды меңгеру Жоспары: Целлоидинді блоктарды кесу Қатырғыш микротомда кесу. Целлоидинді блоктарды кесу үшін А және В типті пышақтарды парафинді блоктарға қарағанда азырақ еңкею бұрышымен пайдаланады. Кесу бұрышы үшкір болуы шарт және блоктың тығыздығына байланысты (блок неғұрлым жұмсақ болған сайын, пышақ соғұрлым үшкір). Блокты бекіту және алдын ала дайындау парафинді кесінділерді алғандыкіндей. Кесу кезінде блок пен пышаққа үздіксіз 70-80% спирт жағып отырады. Целлоидинді кесінділер парафиндіге қарағанда ұйығыштыққа қабілеті аз және пышаққа жабыспайды. Сондықтан оралып қалған жағдайда қаламсаппен пышақтың үстінде-ақ жайып тастауға болады. Дайын целлоидинді кесінділерді 70% спиртке салады да, еркін қалқып жүрген кесіндіге де, сонымен қатар заттық шынығажабыстырғаннан кейін жүргізуге болатынкелесі өңдеугедейін сақтайды. Соңғы жағдайда жапсыруды тікелей бояудың алдында жүргізеді. Кең таралған тәсілдердің бірі Рубашкин тәсілі болып табылады. Жайылған целлоидинді кесіндіні қалақшамен белок пен глицерин жағылған заттық шыныға ауыстырады және бүктелген тегіс фильтр қағазымен басып қояды. Осыдан кейін кесінділерге таза қалампыр майын құяды. Олар толық ағарғаннан кейін (5-20 мин) майды төгіп тастайды, заттық шыныны кесіндімен абсолютті немесе 96% спиртке салады, оны өз кезегінде 2-3 рет әр 5-10 минсайын (целлоидин ісіну үшін) ауыстырып тұрады. Одан кейін целлоидин толық еруі үшін жапсырылған кесінділерді спирт-эфиргенемесе метил спиртіне салады және конценнтрациясы төмендеп отыратын спирттерден (суға дейін) өткізіп тұрады. Целлоидин-парафинді кесіндіні дайындау парафинді блоктарды кесіп кесінді алудан еш айырмашылығы жоқ, жабыстыруы да дәл солай. Қатырғыш микротомда кесу. Әдетте қатырғыш микротомда формалин немесе спиртте бекітілген, сонымен қатар желатинге құйылған материалды кеседі. Сынап дихлориді құрамында бар ерітінділерде фиксациялау ұсынылмайда, өйткені сынап кесу сапасын төмендетеді (пышақтың ұстарасы зақымдалады). Материалды қатырғыш микротомда кеспей тұрып, баллонда көмірқышқылдың болуын және мұздатқыш үстелге келуін тексеру керек. Ол үшін баллонның вентилін ашып, газ берілуді реттейтін тұтқаны бұрып қою керек.Кесуге жарайтын фиксирленген материалды ағын суы бар ыдысқа салады және бірнеше сағат шаяды (әдетте бір түнге қояды). Кейін қалыңдығы 4-6 мм бөлшек кесіп кесіп алып, дистилденген суы бар чашкаға салады. С типті кіші микротомды пышақты пышақұстағыштың саңылауында винтпен бекіткеннен соң, 450 жуық еңкею бұрышын орнатып, шекті артқы қалыпқа қояды. Одан соң материалдың дайындалған бөлшегін судан шығарып, мұздатқыш камераның ылғалданған бетіне немесе суланған фильтр қағазының бетіне қояды және керекті бағытта бағдарлап қояды. Бұдан соң беру кранын қысқа уақытты ашып-жабу арқылы зерттелетін материалды қатырады. Мұздатуды жылдамдату үшін препараты бар камераны микротомның жабдықтар комплектына кіретін арнайы қалың қабырғалы стақанмен жауып қояды. Егер ол жоқ болса, мөлшері сәйкес келетін лабораториялық стақанды осы мақсаттармен бейімдеп қойса болады. Объектіні қатырумен бір уақытта көмірышқылды арнайы түтікпен жібере отырып пышақты да салқындату керек. Мұздату аяқталғаннан кейін (оны препараттың ағаруы және қатаюы арқылы білуге болады) кесіндінің керекті қалыңдығына микрометрикалық шкаланы орнатып, пышақты объектінің үстіне орнатып, беруші механизмнің тұтқасын бұрау арқылы бөлшек үстелшені пышақтың ұстарасының деңгейіне дейін жеткізеді. Сонан соң пышақты тұтқасы арқылы өзіңе қарай қозғалтып, материалды кесуді бастайды. Тұтқаны әр шекті артқы қалыпқа жіберген сайын препараты бар үстелшені автоматты түрде керекті биіктікке көтеріледі. Кесіндіні пышақтан қаламсаппен немесе саусақпен алады және дистилденген суы бар чашкаға салады. Ол онда бірден жайылады. Егер кесінділерді біраз уақыт сақтау керек болса, жайылғаннан кейін оларды 10-12% формалин ерітіндісіне салған жөн. Желатинді блоктарды да дәлсондай жолмен кеседі, алайда оларды суыту ұзағырақ болады, ал қатуы жақсырақ жүреді, егер үстелшеге сіңдіру үшін су емес, желатинді тамызып тұрса. Кесу сапасы жақсару үшін бірінші мұздағаннан кейін блокты ерітіп барып, қайта қатырады. Кесінділерді суық суға немесе 30% спиртке жинайды, олар онда оңай жайылады. Қажет болған жағдайда кесінділерді 10% формалиннің ерітіндісіне салады. Мұздатқыш микротом арқылы алынған кесінділерді көбінесе еркін жүзіп жүрген күйінде өңдейді. Алайда керек болғанда оларды алдын ала заттық шыныға жапсырып қоюға болады. Осы үшін оларды 30% спиртке салады, сосын белок пен глицерин жағылған заттық шыныға ауыстырады, жаяды және 30% спиртпен ылғалдатылған тегіс фильтр қағазымен басып қояды. Бұдан кейін кесінділерді 50 мл 50% спирт және 7,5 мл формалиннің қоспасына салады(1 мин), дистилденген сумен мұқият шаяды және бояйды. Жаңа, фиксирленбеген материалдан мұздатқыш микротоммен жақсы кесінді алу қиындатылған, әсіресе келесі өңдеуде бекіту сатысы болмаса (мысалы, ферменттерді гистохимиялық анықтау). Фиксирленбеген қатқан блоктарды суытылған пышақпен кескенде кесінділер бүктеліп қалмайды және суық қаламсаппен тікелей заттық шыныға ауыстырады, олар онда арнайы желімдегіш заттарсыз жабысып, кеуіп кетеді. Арнайы ортаға құю кезіндгідей, мұздатқыш микртоммен кескенде бір уақытта екі бөлшектен кесінділер алу мүмкін. Ол үшін салыстырылып жатқан объектілерден түрлі пішінді бөлшек кесіп алып, үстелшеде орналастырып, қатырады және кеседі. Кесінділердің әртүрлі формасы оларды бір-бірінен ажыратуға көмек береді. Келесі өңдеуді де бір уақытта жүргізеді, ал бояғаннан соң салыстырмалы кесінділерді бір заттық шыныға салып, аралас препарат дайындайды. Алайда ең жақсы кесінділерді жаңадан қатқан ұлпалардан арнайы тоңазытқыш аппарат – криостаттан алады. Криостатпен жұмыс істеудің негізгі тәсілдері. Криостаттан жаңадан қатырылған кесінді дайындау үшін материал алмас бұрын, камераға микротомды пышақ, қаламсап, скальпель, препаратты ине және шыныларды тіреуішті салу керек, криостатты салқындатқыш агрегатқа қосып, камерадағы температура жұмыс режиміне жетпейінше күту керек (-12-150 С). Кейін материалды микротомнан алынған блокұстағышқа салады және оны алдын ала бетін сумен сулап қояды, керекті қалыпта бағдарлап қояды, қатырып қояды. Егер материалды тез арада алу керек болса және криостат жұмыс режиміне кіргенше күтетін уақыт болмаса, қатқан объектісі бар блокұстағышты суық фольгаға орап, ылғалдың қатып қалуын болдырмау үшін бюкске салып, тоңазытқыштың мұздатқыш камерасына орналастырып қояды (температура -8-100С аспаса). Негізгі қойылатын талап – блоктың еруіне жол бермеу. Сондай-ақ қатқан блоктарды бірнеше күндер бойы сақтауға болады. Блокұстағышты объектімен бірге салқындатушы камераға апарып, микротомға орналастырады. Одан кейін салқындатқыш камерадағы скальпельмен бөлшекке керекті пішін беріп, микротомда бекітіп, кесуді бастайды. Егер суыту деңгейі дұрыс таңдалған болса (әртүрлі тығыздықты материалға әр түрлі температуралық режим қажет) және ұйытуға қарсы құрылғы жақсы реттелген болса,кесінділер пышаққа жақсы жатады. Кесінділер оралып қалған кезде оларды пышақта жайған дұрыс. Таза майсызданған бөлме температурасындағы заттық шыныны камераға салып, абайлап кесіндіге жақындатады. Температураның әртүрлілігіне байланысты кесінді пышақтан ажырап, заттық шыныға жабысады.Кесіндімен қоса шыныларды бөлме температурасында құрғатады немесе келесі жүретін өңдеулерге байланысты әртүрлі сұйықтықтарда бекітеді. Бекітілмеген материалдарды криостатта кескен кезде алты, тіпті сегіз бөлшектен біріккен кесінділер жасау мүмкін. Бұл кезде олардың жабысуы мен қатуы соншалықты тығыз, олардың шекарасын тіпті микроскоптан ажыратқан қиын. Есте сақтар жәйт, жақсы кесінділер алу үшін бөлшек белгілі бір күйге дейін салқындатылуы тиіс. Егер кесінді уатылатын болса, объект қатты мұздап кеткен және ол еріп, керекті қаттылыққа ие болғаншакүте тұру керек. Ал егер кесінді мыжылатын болса, ол жеткіліксіз мұздатылған және оны сәл қатыру керек. Қолданылатын әдебиеттер: 1. С.М. Шалгимбаева, Ж.С. Омарова, Г.Б. Джумаханова Микротехника негіздері Алматы, Қазақ университеті, 2021, 71 б. 2. Хегай И.В., Кобегенова С.С. Методическое руководство по курсу «Основы микротехники» Алматы. Қазақ университеті. 1999. 3. Нуртазин С.Т. Жалпы гистология, Алматы – 2010 . 220 б. 4. Афанасьева Ю.И., Юрина Е.Ф., Котовский и др Гистология. Учебник М.: Медицина 2011 Н.А. жүктеу/скачать 152,73 Kb. Достарыңызбен бөлісу:
|